"МУК 4.1.2859-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Фенпироксимата в яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 01.12.2010 N 0062.30.11.10.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Фенпироксимата в яблочном соке в диапазоне 0,1 - 1,0 мг/кг.

Структурная формула (не приводится).

Название действующего вещества по ИЮПАК:

Трет-бутил-(Е)-а-(1,3-диметил-5-феноксипиразол1-4-илметилена-мино-окси)-р-толуат.

Молекулярная масса: 421,5.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белый без запаха.

Давление паров: 0,0075 мПа (при 25 °С).

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 25 °С): ацетон - 150; дихлорметан - 1307; метанол - 15; хлороформ - 1197; тетрагидрофуран - 737.

Стабилен в кислой и щелочной средах.

Область применения: Фенпироксимат - акарицид, который ингибирует митохондриальный транспорт электронов. Действует на стадиях личинок, нимф и взрослых особей. Применяется на посадках цитрусовых, яблок, персиков, груш, винограда в концентрации 25 - 75 г/га.

Проходит регистрационные испытания на яблонях с нормой расхода 0,75 куб. дм/га.

В России для Фенпироксимата установлены следующие гигиенические нормативы: МДУ в яблочном соке - 0,2 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Фенпироксимата с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и очистки экстракта на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак Амин.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С и Диапак Амин для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения Фенпироксимата на концентрирующих патронах Диапак С и Диапак Амин, установление градуировочной характеристики.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 800 куб. см ацетонитрила и 200 куб. см очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Фенпироксимата 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг Фенпироксимата в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Фенпироксимата 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Фенпироксимата 1,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для хроматографического исследования и приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 3 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Фенпироксимата 0,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для хроматографического исследования и приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 4 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Фенпироксимата 0,2 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для хроматографического исследования и приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 5 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией Фенпироксимата 0,1 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для хроматографического исследования и приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 6 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.7. Стандартные растворы Фенпироксимата с концентрацией 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 мкг/куб. см для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 10,0; 5,0; 2,0 и 1,0 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Фенпироксимата в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка последовательно соединенных концентрирующих патронов Диапак С (внизу) и Диапак Амин (вверху) для очистки экстракта.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1 - 2 кап./с).

Патрон Диапак Амин устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 куб. см смеси гексана. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения Фенпироксимата на последовательно соединенных концентрирующих патронах Диапак С (внизу) и Диапак Амин (вверху).

Из стандартного раствора Фенпироксимата в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, перемешивают и вносят на подготовленные патроны. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают двумя порциями по 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и последовательно вносят на патроны. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие Фенпироксимат, полноту смывания с патронов и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Фенпироксимата на концентрирующих патронах Диапак Амин и Диапак С проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 ч.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.1979 N 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ 656-79 "Соки плодовые и ягодные натуральные. ТУ".

Пробы яблочного сока хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С не более 5 суток.

9.1.1. Экстракция

Образец яблочного сока массой 10 г помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и перемешивают. Туда же прибавляют 20 куб. см ацетонитрила и встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в химический стакан объемом 50 куб. см, а верхний ацетонитрильный слой - в химический стакан объемом 100 куб. см. Повторяют экстракцию два раза, используя каждый раз по 20 куб. см ацетонитрила и встряхивая делительную воронку в течение 2 мин. Водный слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт объединяют в химическом стакане объемом 100 куб. см. Объединенный ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку, выдерживают 5 мин. при комнатной температуре, выделившуюся водную фазу (нижний слой) отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт переносят через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см, обмывают осушитель 10 куб. см ацетонитрила, объединяют смыв с основным экстрактом и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 куб. см ацетона, 50 куб. см дистиллированной воды и 10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Фенпироксимат экстрагируют тремя порциями гексана по 20 куб. см, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в химический стакан объемом 50 куб. см, а верхний гексановый слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.3. Очистка экстракта на последовательно соединенных концентрирующих патронах Диапак С (внизу) и Диапак Амин (вверху)

Сухой остаток, полученный в п. 9.1.2, растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, перемешивают и вносят на подготовленные патроны. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и последовательно вносят на патроны. Элюат собирают в тот же концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Хроматограф жидкостный Waters 515 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации N 15311-02, или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Предколонка стальная Symmetry C8, 20 мм х 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 80:20.

Длина волны: 258 нм.

Время удерживания Фенпироксимата: 7,404 мин. +/- 2%.

Чувствительность не менее 0,005 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Empower 2.

Альтернативная обработка результатов.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,1 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,1 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (495) 976-37-68, факс: (495) 976-43-26.