"МУК 4.1.3053-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств дифловидазина в огурцах, зеленой массе, зерне и масле сои методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 05.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 5 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.092/01.00043/2012.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии с термоионным детектором для определения массовой концентрации дифловидазина в огурцах в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в зеленой массе 0,02 - 0,2 мг/кг, зерне сои 0,01 - 0,1 мг/кг, масле сои 0,05 - 0,5 мг/кг или метод газожидкостной хроматографии с насадочной колонкой и электронозахватным детектором (ДПР) в огурцах в диапазоне концентраций 0,002 - 0,02 мг/кг, в зеленой массе 0,004 - 0,04 мг/кг, зерне сои 0,002 - 0,02 мг/кг, масле сои 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Дифловидазин (синоним флуфензин)

3-(2-хлорфенил)-6-(2,6-дифторфенил)-1,2,4,5-тетразин (IUPAC).

Мол. масса: 304,69.

Химически чистый препарат - кристаллическое вещество пурпурного цвета без запаха.

Температура плавления: 185,4 +/- 0,1 °C.

Давление паров - .

Коэффициент распределения н-октанол/вода: .

Растворимость: в воде при 20 °C - 0,2 +/- 0,03 мг/л; в н-гексане - 168, метаноле - 1,3, ацетоне - 24 (в г/л при 20 °C). Стабилен в ацетоне, метаноле и гексане.

Вещество стабильно на свету и на воздухе, разлагается около точки плавления; стабильно в кислой среде, гидролизуется при pH > 7, 60 час (pH 9, 25 °C, 40% ацетонитрил).

Краткая токсикологическая характеристика: Относится к III классу опасности (малоопасен). Острая пероральная токсичность для крыс 594 - 979 мг/кг. Практически не токсичен для пчел, птиц и почвенных микроорганизмов.

Гигиенические нормативы: МДУ (для импортируемой продукции) в плодовых семечковых 0,04, в винограде 0,02 мг/кг.

Область применения: контактный акарицид с трансламинарной активностью, применяется на винограде, яблоне, сое и других культурах.

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей +/- 25%, при доверительной вероятности 0,95.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

--------------------------------

<*> Соответствует расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k = 2.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20, P = 0,95) приведены в таблице 2.

Методика основана на извлечении дифловидазина из растительных проб органическим растворителем с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкостями и на патронах с силикагелем. Количественное определение проводят методом капиллярной газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора или газовой хроматографии с насадочной колонкой с электронозахватным детектором (или детектором постоянной скорости рекомбинации). Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки.

Газовый хроматограф с термоионным детектором и капиллярной колонкой или газовый хроматограф с электронозахватным детектором и насадочной колонкой.

Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г, ГОСТ 24104-2001.

Микрошприц объемом 10 куб. мм, ТУ 2-833-106.

Колбы мерные на 10, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 29227-91.

Микродозаторы переменного объема от 100 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см, ГОСТ 50444.

Цилиндры мерные на 100 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аналитический стандарт дифловидазина 99,9%

Ацетон, химически чистый, ТУ 6-09-3513-82.

Ацетонитрил, химически чистый, ТУ 6-09-3534-87.

Азот газообразный в баллонах с редуктором, ТУ-6-16-40-14-88.

Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72.

Гексан, химически чистый, ТУ 2631-003-05807999-98.

Насадка для аналитической колонки с 5% полярной фазы на инертном носителе (0,16 - 0,20 мм).

Натрий сернокислый безводный, чистый, ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, химически чистый, ГОСТ 4233-77.

Хлороформ, химически чистый, ГОСТ 20015-94.

Этиловый эфир уксусной кислоты, чистый для анализа, ГОСТ 22300-76.

Элюент для очистки на патронах N 1: гексан-этилацетат (90:10 по объему).

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Воронки лабораторные, ГОСТ 25336-82Е.

Воронки делительные объемом 500 куб. см, ГОСТ 8613-75.

Колбы плоскодонные на шлифах объемом 500 куб. см, ГОСТ 25336-82Е.

Колбы круглодонные на шлифах объемом 50 куб. см, ГОСТ 25336-82Е.

Колонка капиллярная кварцевая 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, с полярной фазой (0,25 мкм).

Колонка стеклянная насадочная длиной 2 м, внутренним диаметром 3 мм.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, 0,6 г, ТУ 4215-002-0545-931-94.

Пробирки с притертыми пробками на 5 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Ультразвуковая ванна с рабочей частотой 35 кГц, ТУ 3.836.008.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Фильтры бумажные средней плотности, ТУ 6.091678-86.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.007-76).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/кв. см), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением" ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом капиллярной газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 20 +/- 5 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с техническими условиями по ГОСТ 1726-85 "Огурцы свежие". Пробы огурцов и зеленой массы сои хранятся до анализа в морозильной камере при температуре -18 °C.

Отбор проб зерна и масла сои производится по ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Для длительного хранения зерно сои подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла сои хранят в холодильнике при 0 - 4 °C в закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °C до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

Перед началом анализа насадочную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °C в течение 8 - 10 часов.

Капиллярную колонку, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 280 °C до получения стабильной нулевой линии.

Берут точную навеску дифловидазина (50 мг), переносят в мерную колбу на 50 куб. см, растворяют навеску в ацетоне и доводят до метки (основной раствор с концентрацией 1,0 мг/куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему в 100, 50, 10 и 5 раз, используя для разбавления гексан. Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 3 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют градуировочные растворы.

Непосредственно перед употреблением через патрон, заполненный гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, пропускают 5 куб. см гексана.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация дифловидазина в растворе) в хроматограф вводят по 1 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты или площади пиков и строят график зависимости среднего значения высоты (площади) пика от концентрации дифловидазина в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации дифловидазина в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации дифловидазина в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( = 10% при P = 0,95).

Навеску измельченных огурцов массой (20 +/- 0,1) г помещают в коническую колбу на 250 куб. см, заливают 50 куб. см ацетона и экстрагируют дифловидазин в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр. Экстракцию повторяют еще раз 30 куб. см ацетона. Объединенный фильтрат упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C до водного остатка. К водному остатку добавляют 30 куб. см дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр. Раствор помещают в делительную воронку на 250 куб. см, добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия и 30 куб. см хлороформа. Воронку встряхивают в течение 2 - 3 мин. и после разделения слоев нижний хлороформный слой собирают. Экстракцию дифловидазина повторяют еще 2 раза порциями по 30 куб. см хлороформа. Объединенные хлороформные экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого натрия. Полученный раствор выпаривают на ротационном испарителе при температуре бани 40 °C до полного удаления хлороформа. Сухой остаток растворяют в 100 куб. мм ацетона, добавляют 1,9 куб. см гексана и хроматографируют. При необходимости проводят дополнительную очистку экстракта по п. 9.2.

Зеленая масса и зерно сои. Навеску измельченной зеленой массы (10 +/- 0,1) г или измельченного на лабораторной мельнице зерна (20 +/- 0,1) г заливают 50 куб. см ацетона и экстрагируют дифловидазин в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют 30 куб. см ацетона. Полученный объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C до объема 4 - 5 куб. см, добавляют к остатку 30 куб. см дистиллированной воды и фильтруют через бумажный фильтр. К полученной смеси добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия и 30 куб. см хлороформа и помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см. После расслоения нижний хлороформный слой сливают, из верхнего водно-ацетонового слоя экстрагируют дифловидазин хлороформом еще дважды порциями по 30 куб. см. Объединенные хлороформные экстракты фильтруют через слой безводного сернокислого натрия. Полученный раствор выпаривают на ротационном испарителе при температуре бани 40 °C до полного удаления хлороформа. Далее очистку проводят на патронах с силикагелем по п. 9.2.

Масло сои. Навеску масла (10 +/- 0,1) г растворяют в 50 куб. см гексана, отбирают 1/5 часть раствора (что соответствует 2 г масла) в делительную воронку, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и встряхивают воронку в течение 2 минут. После расслоения жидкости нижний ацетонитрильный слой собирают, гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрил удаляют на ротационном испарителе при температуре 40 °C до сухого остатка.

Дальнейшую очистку проводят на патронах с силикагелем по п. 9.2.

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. п. 9.1.1 и 9.1.2 экстрактов, растворяют в 50 куб. мм ацетона и затем количественно переносят тремя порциями по 0,5 куб. см гексана в патрон. Гексановый элюат отбрасывают. Дифловидазин элюируют 3 куб. см элюента N 1 (гексан:этилацетат 90:10). Элюат собирают в пробирку и упаривают в токе азота. Сухой остаток растворяют в 100 куб. мм ацетона, добавляют 1,9 куб. см гексана и хроматографируют. Для проб масла сухой остаток растворяют в 100 куб. мм ацетона, добавляют 0,9 куб. см гексана и 1 куб. мм раствора вводят в хроматограф.

9.3.1. Газовый хроматограф с термоионным детектором и кварцевой капиллярной колонкой длиной 30 м, диаметром 0,25 мм (толщина слоя неподвижной фазы - 0,25 мкм). Температура колонки программируется от 120 °C (2 мин.) до 250 °C (2 мин.) со скоростью 20 °C/мин. Температура детектора 380 °C, испарителя 300 °C. Расход газа-носителя 1 (азот) - 7,2 куб. см/мин. (170 кПа), сброс 4,2 куб. см/мин., поддув в детектор 20 куб. см/мин., расход водорода 11,6 куб. см/мин., воздуха 200 куб. см/мин. Деление потока 1:2. Дозируемый объем 1 куб. мм.

9.3.2. Газовый хроматограф с электронозахватным детектором и насадочной колонкой.

Колонка стеклянная 2 м x 3 мм, заполненная инертным носителем с 5% полярной фазы.

Температура колонки 250 °C, испарителя 300 °C, детектора 330 °C.

Скорость газа-носителя (азот) через колонку 40 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы 1 мм.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2 нг.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание дифловидазина в образце огурцов, зеленой массы, зерна или масла сои (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где - высота (площадь) пика дифловидазина в стандартном растворе, мм (мв x сек.);

- высота (площадь) пика дифловидазина в анализируемой пробе, мм (мв x сек.);

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

P - навеска анализируемого образца, г;

C - концентрация дифловидазина в стандартном растворе, мкг/куб. см.

Содержание остаточных количеств дифловидазина в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор дифловидазина 2 мкг/куб. см (анализ с термоионным детектором) или 0,2 мкг/куб. см (анализ с электронозахватным детектором), разбавляют.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения в масле сои.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

12.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

где , X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 4) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры () с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где , - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.