"МУК 4.1.3080-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение концентраций циклоксидима в воздухе рабочей зоны и смывах с кожных покровов операторов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.07.2013)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, М.В. Ларькина, С.К. Рогачева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации МВИ от 5.03.2013. N 01.00282-2008/0159.05.03.13.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода жидкостной хроматографии для определения в воздухе рабочей зоны и смывах с кожных покровов операторов массовой концентрации циклоксидима в диапазонах 0,1 - 1,0 мг/м³ и 0,5 - 5,0 мкг/смыв соответственно.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: циклоксидим.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (5RS)-2-[(EZ)-1-этоксиимино]бутил]-3-гидрокси-5-(3RS)-тиан-3-ил]циклогекс-2-ен-1-он.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₇H₂₇NO₃S.

Молекулярная масса: 325,5.

Бесцветный кристаллический порошок без запаха. Температура плавления 37,1 - 41,2 °C. Давление паров 1,0·10^-2 мПа (при 20 °C). Растворимость в органических растворителях (при 20 °C): > 2,5 г/дм³ в метаноле, ацетоне, дихлорметане, этилацетате. Растворимость в воде при 20 °C - 0,053 г/дм³ (pH 4,3). Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_OW logP = 3,09 (pH 5).

Агрегатное состояние в воздушной среде - аэрозоль.

Циклоксидим - гербицид химического класса циклогексенонов, рекомендуемый для борьбы с однолетними и многолетними злаковыми сорняками на различных культурах (соя, сахарная свекла, картофель, кукуруза, подсолнечник).

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей +/- 25%, при доверительной вероятности 0,95.

Измерения концентраций циклоксидима выполняют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором.

Концентрирование вещества из воздуха осуществляют на пробоотборные трубки или бумажные фильтры высокой плотности, экстракцию проводят ацетоном. Смыв с кожных покровов проводят этиловым спиртом.

Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 5 нг. Средняя полнота извлечения с трубок - 94,1%, с поверхности кожи - 94,6%.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на газовом хроматографе, и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 12.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление растворов для градуировки и внесения, установление градуировочной характеристики, подготовка салфеток для отбора проб, отбор проб.

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Перегнанный растворитель хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм³ ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм³ ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.2.1.1. Приготовление раствора муравьиной кислоты с массовой долей 0,1% (0,1%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 500 см³ бидистиллированной или деионизованной воды, вносят 1 см³ муравьиной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

7.2.1.2. Приготовление подвижной фазы N 1. В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 250 см³ ацетонитрила, добавляют 750 см³ 0,1%-го раствора муравьиной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр и дегазируют.

Подвижную фазу N 1 хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

В мерную колбу вместимостью 1 000 см³ помещают 650 см³ ацетонитрила, добавляют 350 см³ бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр и дегазируют.

Подвижную фазу N 2 хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

Промывают колонку N 1 подвижной фазой N 1 (приготовленной по п. 7.2.1) и колонку N 2 подвижной фазой N 2 (приготовленной по п. 7.2.2) при скорости подачи растворителя 1,0 см³/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Исходный раствор циклоксидима для градуировки (концентрация 100 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 0,0100 г циклоксидима и растворяют в 50 - 60 см³ ацетонитрила, доводят ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение месяца.

Растворы N 1 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.4.2. Раствор N 1 циклоксидима для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см³). В мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 10 см³ исходного раствора с концентрацией циклоксидима 100 мг/см³ (п. 7.4.1), разбавляют ацетонитрилом до метки.

Раствор N 1 хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено - найдено", а также контроле качества результатов методом "добавок".

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 5 циклоксидима для градуировки (концентрация 0,25 - 2,5 мкг/см³). В 3 мерные колбы вместимостью 100 см³ помещают по 2,5; 5,0, 10,0 градуировочного раствора N 1 с концентрацией 10 мкг/см³ (п. 7.4.2). Для приготовления рабочего раствора N 5 с концентрацией 2,5 мкг/см³ в мерную колбу вместимостью 100 см³ помещают 2,5 см³ исходного раствора циклоксидима с концентрацией 100 мг/см³. Растворы доводят до метки подвижной фазой N 1 или 2, приготовленными по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией циклоксидима 0,25; 0,5; 1,0 и 2,5 мкг/см³ соответственно.

Рабочие растворы готовят непосредственно перед применением.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость суммы площадей 2 пиков Z- и E-изомеров циклоксидима от концентрации вещества в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования, указанных по п. 7.5.1 или 7.5.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков изомеров действующего вещества, рассчитывают сумму площадей Z- и E-изомеров циклоксидима, на основании которых строят градуировочную зависимость.

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

7.5.1. Ультраэффективный жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Хроматографическая колонка стальная, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (150 x 4,6) мм, зернением 5 мкм.

Рабочая длина волны: 256 нм.

Температура колонки: 24 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-0,1%-я муравьиная кислота, градиентное элюирование.

Режим элюирования (градиентный), пробег 20 мин (табл. 1).

Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 5 - 50 нг.

7.5.2. Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны.

Хроматографическая колонка стальная, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C8, (250 x 4,6) мм, зернением 5 мкм.

Рабочая длина волны: 256 нм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза N 2: ацетонитрил-вода (65:35, по объему).

Скорость потока элюента: 1,0 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 20 мм³.

Линейный диапазон детектирования: 2 - 20 нг.

Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см³, растворяют в деионизированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

Вырезают салфетки (лоскуты) из белой бязи размером 10 x 10 см, затем их последовательно обрабатывают 5%-м раствором углекислого натрия (при кипячении), водой до нейтральной реакции промывных вод, 2-кратно промывают этиловым спиртом, сушат на воздухе при комнатной температуре. До использования салфетки хранят в герметично закрытой стеклянной таре.

Отбор проб осуществляют в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны" и Р 2.2.2006-05 (прилож. 9, обязательное) "Общие методические требования к организации и проведению контроля содержания вредных веществ в воздухе рабочей зоны", п. 2 "Контроль соответствия максимальным ПДК".

Воздух с объемным расходом 1 - 2 дм³/мин аспирируют через трубки для отбора проб воздуха, заполненные пористым полимерным сорбентом или бумажный фильтр, помещенный в фильтродержатель.

Для измерения концентрации циклоксидима на уровне предела обнаружения (0,1 мг/м³) необходимо отобрать 5 дм³ воздуха.

Срок хранения отобранных проб, помещенных в полиэтиленовые пакеты, в морозильной камере при температуре -18 °C 15 дней.

Смывы проводят в конце работы или после выполнения отдельных операций с открытых и закрытых спецодеждой или другими СИЗ участков тела (лоб, лицо, шея, грудь, предплечье, голень, кисти рук, включая межпальцевые промежутки).

До работы выбирают участок кожи, обрабатывают его для удаления загрязнений, фиксируют площадь (не менее 200 см²). При необходимости отбирают фоновые смывы.

Смыв выполняют способом обмыва фиксированного участка кожи этиловым спиртом, помещая 20 см³ в стеклянную емкость с металлической крышкой. Тканевой салфеткой, смоченной растворителем, с помощью пинцета (индивидуально) обмывают этот участок сверху вниз. Операцию повторяют дважды.

Срок хранения отобранных проб смывов, помещенных в герметично закрытые емкости, в морозильной камере при температуре -18 °C 30 дней.

Содержимое экспонированной пробоотборной трубки (пористый полимерный сорбент и стекловату) переносят в градуированные пробирки на 10 см³, заливают 5 см³ ацетона, помещают на ультразвуковую ванну на 3 мин, затем на встряхиватель на 10 мин. Растворитель сливают, трубки еще трижды обрабатывают новыми порциями ацетона объемом 5 см³.

Экспонированный фильтр переносят в химический стакан вместимостью 150 см³, заливают 10 см³ ацетона, помещают на встряхиватель на 20 мин. Растворитель сливают, фильтр еще дважды обрабатывают новыми порциями ацетона объемом 10 см³, выдерживая на встряхивателе по 10 мин.

Объединенный экстракт переносят (через воронку) в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C почти досуха, оставшийся растворитель отдувают потоком теплого воздуха. Остаток растворяют в 2 см³ соответствующей подвижной фазы (подготовленной по п. 7.2), тщательно перемешивают и анализируют при условиях хроматографирования, указанных в п. 7.5.1 или 7.5.2.

Пробу смыва сливают (через воронку) в колбу для упаривания, с помощью пинцета извлекают салфетку, помещают в конусную химическую воронку, установленную в муфту колбы для упаривания, тщательно отжимают и промывают этиловым спиртом дважды порциями по 10 см³, предварительно ополаскивая растворителем емкость, в которой находилась проба.

Объединенный раствор упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C почти досуха, оставшийся растворитель отдувают потоком теплого воздуха. Остаток растворяют в 2 см³ соответствующей подвижной фазы (подготовленной по п. 7.2) и анализируют при условиях хроматографирования, указанных в п. 7.5.1 или 7.5.2.

Пробу вводят в испаритель хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков изомеров действующего вещества, суммируют их, с помощью градуировочного графика определяют концентрацию циклоксидима в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие сумму пиков площадей большую, чем градуировочный раствор с концентрацией 2,5 мкг/см³, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

Концентрацию вещества в пробе воздуха (X), мг/м³, рассчитывают по формуле:

C - концентрация циклоксидима в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков изомеров, мкг/см³;

W - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

V_t - объем пробы воздуха, отобранный для анализа, приведенный к стандартным условиям (давление 760 мм рт. ст., температура 20 °C), дм³:

T - температура воздуха при отборе проб (на входе в аспиратор), °C;

P - атмосферное давление при отборе пробы, мм рт. ст.;

u - расход воздуха при отборе пробы, дм³/мин;

t - длительность отбора пробы, мин;

R - коэффициент, равный 0,386 для воздуха рабочей зоны.

Концентрацию вещества в пробе смыва X, мкг/смыв, рассчитывают по формуле:

C - концентрация вещества в хроматографируемом растворе, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной суммы площадей хроматографических пиков изомеров, мкг/см³;

W - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³.

Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

Результат количественного анализа представляют в виде:

- результат анализа в мг/м³ или мкг/смыв (с указанием площади смыва в см²), характеристика погрешности , % (табл. 2), P = 0,95 или

(мкг/смыв, площадь смыва, см²), P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, мг/м³ (мкг/смыв);

- граница абсолютной погрешности, мг/м³ (мкг/смыв):

- граница относительной погрешности методики (показатель точности по диапазону концентраций, табл. 2), %.

Результат измерений должен иметь тот же десятичный разряд, что и погрешность.

Если содержание вещества менее нижней границы, диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание циклоксидима в пробе воздуха рабочей зоны - менее 0,1 мг/м³; в пробе смыва - менее 0,5 мкг/смыв" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,1 мг/м³; 0,5 мкг/смыв - пределы обнаружения при отборе 5 дм³ воздуха рабочей зоны; в пробе смыва (фиксированная площадь смыва, 200 см²) соответственно.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

- среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в пробе (мг/м³, мкг/смыв).

12.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов растворов для градуировки, содержание циклоксидима в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,25 до 2,5 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

X - концентрация циклоксидима в пробе при контрольном измерении, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора циклоксидима, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов циклоксидима, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

12.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Образцами для контроля являются реальные пробы воздушной среды и смывов с кожных покровов. Объем отобранных для контроля процедуры выполнения анализа проб воздуха и смывов с кожи должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике, фиксированная площадь смыва должна быть увеличена в 2 раза. После отбора проб экстракт с фильтра или с пробоотборной трубки, а также пробу смыва делят на две равные части, первую из которых анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы - X. Во вторую часть делают добавку анализируемого компонента (величина добавки C_д должна соответствовать 50 - 150% от содержания компонента в пробе, общая концентрация не должна превышать верхнюю границу диапазона измерения) и анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа рабочей пробы с добавкой - X'. Результаты анализа исходной рабочей пробы (X) и рабочей пробы с добавкой (X') получают в условиях повторяемости (один аналитик, использование одного набора мерной посуды, одной партии реактивов и т.д.).

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой), мг/м³, мкг/смыв.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения с последующим уточнением но мере накопления информации, где - граница абсолютной погрешности, мг/м³, мкг/смыв:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 2), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры К_к с нормативом контроля К.

Результат контрольной процедуры К_к рассчитывают по формуле:

, , C_д - среднее значение массовой концентрации анализируемого компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно (мг/м³, мкг/смыв).

Норматив оперативного контроля точности К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

12.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

R - предел воспроизводимости (табл. 2), мг/м³, мкг/смыв.

(воздух рабочей зоны);

(смывы с кожи), где

, где X₁, X₂ - результаты измерений в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/м³, мкг/смыв.

Если выполняется условие (2), то воспроизводимость измерений считается удовлетворительной.

При превышении норматива контроля воспроизводимости эксперимент повторяют, при повторном превышении указанного норматива выясняют причины и по возможности их устраняют.