"МУК 4.1.3054-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств карбоксина в зерне кукурузы, сои и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором РФ 05.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 5 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.128/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации карбоксина в зерне кукурузы, зерне сои и растительном масле в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Карбоксин

5,6-дигидро-2-метил-1,4-оксатиин-3-карбоксанилид (IUPAC)

5,6-дигидро-2-метил-N-фенил-1,4-оксатиин-3-карбоксамид (C.A.)

, мол. масса 235,3

Белый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 91,5 - 92,5 °C и 98 - 100 °C (в зависимости от типа кристаллов).

Давление паров при 25 °C: .

Коэффициент распределения н-октанол-вода: .

Растворимость (в г/куб. дм при 20 °C): вода - 0,134, метанол - 89, ацетон - 220, этилацетат - 111, дихлорметан - 353.

Вещество устойчиво к гидролизу (25 °C, pH 5 - 9), быстро разлагается в водных растворах при выдерживании на свету (pH 9, < 3 ч).

Краткая токсикологическая характеристика: острая пероральная токсичность для крыс 2588 мг/кг, острая дермальная токсичность для кроликов > 4000 мг/кг.

Мутагенный эффект при использовании препарата не наблюдался. Класс токсичности по ВОЗ - III.

Область применения препарата: Карбоксин - фунгицид системного действия, используется для обработки семян зерновых культур против головневых болезней, корневых гнилей и плесневения семян. Не применяется совместно с пестицидами, имеющими в молекуле длинные углеводородные цепи или обладающими кислой реакцией.

Гигиенические нормативы для карбоксина в России: ПДК в воде водоемов 0,02 мг/куб. мд; ОДК в почве 0,05 мг/кг; МДУ: кукуруза (зерно), просо, зерно хлебных злаков, картофель - 0,2 мг/кг, кукуруза (масло) - нт.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<*> Соответствует расширенной неопределенности при коэффициенте охвата k = 2.

Методика основана на определении карбоксина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом, очистки экстракта промывкой гексаном и последующей очистки на патронах для твердофазной экстракции.

Идентификация карбоксина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженном дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г, ГОСТ 24104-2001.

Колбы мерные на 10, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см.

Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Карбоксин, аналитический стандарт, 99,2%.

Ацетон, особой чистоты, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил, химически чистый, ТУ 6-09-3534-87.

Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная), ГОСТ Р 52501-2005.

н-Гексан, химически чистый, ТУ 6-09-3375-78.

Кислота ортофосфорная , химически чистая, ГОСТ 6552-80.

Метилен хлористый, химически чистый, ТУ 2631-019-44493179-98.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М в соотношении 30:70.

Смесь N 1: хлористый метилен-ацетон в соотношении 9:1 по объему.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм.

Аппарат для встряхивания проб, ТУ 64-1-1081-73

Воронки делительные вместимостью 250 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10 и 100 куб. см, ГОСТ 9737-93.

Колбы плоскодонные конические вместимостью 100 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, 0,4 г, ТУ 4215-002-0545-931-94.

Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 куб. см.

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Фильтры бумажные средней плотности, ТУ 6.091678-86.

Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4000 об./мин.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 20 +/- 5 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70 по объему, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Для приготовления ацетонитрила, насыщенного гексаном, в делительной воронке смешивают ацетонитрил и гексан в соотношении 5:1, встряхивают в течение 2 мин., после разделения слоев нижний ацетонитрильный слой готов к использованию.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см: точную навеску карбоксина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями карбоксина 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 5,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,05 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 3 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения карбоксина в зерне кукурузы, семенах сои и растительном масле используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация карбоксина в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации карбоксина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

где C - аттестованное значение массовой концентрации карбоксина в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации карбоксина в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( = 10% при P = 0,95).

Патроны для твердофазной экстракции, заполненные гидрофильным слабокислотным сорбентом на основе силикагеля, промывают последовательно 3 куб. см смеси N 1 и 3 куб. см гексана, после чего патрон готов к работе.

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 1 куб. см стандартного раствора карбоксина с концентрацией 1 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током воздуха. Остаток растворяют в 2 куб. см гексана и переносят на подготовленный патрон. Колбу обмывают 2 куб. см гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 куб. см гексана и 2 куб. см хлористого метилена, элюаты отбрасывают. Затем элюируют карбоксин смесью N 1 со скоростью 1 - 2 капли в сек. Отбирают фракции по 2 куб. см, упаривают досуха, растворяют в 1 куб. см подвижной фазы (ацетонитрил - 0,005 М , 30:70) и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие карбоксин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Внимание! Температура бани не должна превышать 30 °C, экстракты следует упаривать осторожно, т.к. вещество достаточно высоколетучее.

Примечание: Проверку хроматографического поведения карбоксина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также отбор проб зерна кукурузы производится по ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовке и поставках", зерна сои - по ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Пробы зерна для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре.

Для длительного хранения зерно подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы растительного масла хранят в холодильнике при 0 - 4 °C в закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.

9.1.1. Экстракция карбоксина из зерна кукурузы и сои

Навеску измельченного зерна (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см и добавляют 30 куб. см ацетонитрила, насыщенного гексаном. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин. и центрифугируют при скорости 4000 об./мин. в течение 10 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют, фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку. К остатку в пробирке добавляют 20 куб. см ацетонитрила, насыщенного гексаном, и проводят повторную экстракцию. Объединенные ацетонитрильные экстракты очищают по п. 9.2.

9.1.2. Экстракция карбоксина из растительного масла

Навеску масла (5 г) растворяют в 50 куб. см гексана, помещают в делительную воронку, добавляют 20 куб. см ацетонитрила, насыщенного гексаном, и интенсивно встряхивают в течение 2 - 3 мин. После полного разделения фаз, нижний ацетонитрильный слой отбирают, к гексановому слою добавляют 20 куб. см насыщенного ацетонитрила и экстракцию повторяют. Объединенные ацетонитрильные экстракты очищают по п. 9.2.

К ацетонитрильному экстракту, полученному по п. 9.1 и помещенному в делительную воронку на 250 куб. см, добавляют 10 куб. см гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 - 3 мин. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и повторяют операцию очистки с новой порцией гексана объемом 10 куб. см.

Затем ацетонитрильный экстракт переносят в колбу для упаривания на 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе.

Внимание! Температура бани не должна превышать 30 °C, экстракты следует упаривать осторожно, т.к. вещество достаточно высоколетучее.

Дальнейшую очистку сухого остатка проводят на патронах для твердофазной экстракции по п. 9.3.

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов по п. 9.2, растворяют в 1 куб. см гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.5). Колбу обмывают 1 куб. см гексана и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 10 куб. см гексана, 2 куб. см хлористого метилена, элюаты отбрасывают. Карбоксин элюируют 3 куб. см смеси N 1. Элюат количественно переносят в круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °C.

Внимание! Температура бани не должна превышать 30 °C, экстракты следует упаривать осторожно, т.к. вещество летучее.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70) и анализируют на содержание карбоксина по п. 9.4.

Ультраэффективный жидкостной хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18. Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70. Скорость потока элюента 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 250 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание карбоксина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

где - площадь пика карбоксина на хроматограмме испытуемого образца, кв. мм (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения карбоксина, приведенная в табл. 2 (%).

Содержание остаточных количеств карбоксина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор карбоксина с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения карбоксина в зерне.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

где , X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры () с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где , - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.