"МУК 4.1.2905-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Изоксафлютола в виде RPA 202248 в масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 0085.25.04.11 от 25.04.2011.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Изоксафлютола в виде RPA 202248 в масле кукурузы в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг.

Название действующего вещества по ИЮПАК:

Изоксафлютол: 5-циклопропил-1,2-оксазол-4-ил-альфа,альфа,альфа-трифтор-2-мезил-ро-толил кетон.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 359.

Основной метаболит Изоксафлютола - RPA 202248.

Название по ИЮПАК:

RPA 202248: 2-циано-3-циклопропил-1-(2-метилсульфонил-4-трифторметилфенил)-пропан-1,3-дион.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 359.

Изоксафлютол - гербицид системного действия, проникающий через корни и листья растений и ингибирующий биосинтез каротиноидов. Хорошо подавляет развитие широколистных и злаковых сорняков в посевах кукурузы при довсходовой обработке или допосевном внесении с нормой расхода 75 - 140 г д.в./га.

В России применяется против однолетних злаковых и двудольных сорных растений в посевах кукурузы с нормой расхода по препарату 0,1 - 0,16 кг/га.

В России установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,002 мг/кг массы человека; ПДК в воде водоемов - 0,02 мг/куб. дм; ОДК в почве - 0,1 мг/кг; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 1,0 мг/куб. м; в атмосферном воздухе - 0,001 мг/куб. м; МДУ в продукции (мг/кг): зерно кукурузы - 0,05.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2

Метод основан на определении RPA 202248 с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, перевода Изоксафлютола в его метаболит RPA 202248 в щелочной среде, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах Диапак Диол.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак Диол для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах Диапак Диол, установление градуировочной зависимости.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/куб. дм. Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей, добавляют туда марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч и затем перегоняют. Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре выше и ниже 100,0 °C, отбрасывают.

7.2.1.1. Приготовление 0,2% (по объему) раствора трифторуксусной кислоты.

В мерную колбу объемом 1000 куб. см помещают 500 куб. см очищенной воды и 2 куб. см 99% трифторуксусной кислоты, перемешивают, доводят объем в колбе до метки очищенной водой, еще раз тщательно перемешивают. Раствор хранится в течение недели при комнатной температуре.

7.2.1.2. Приготовление раствора для разведения проб.

Мерным цилиндром объемом 100 куб. см отмеряют 80 куб. см ацетонитрила и помещают в коническую колбу на 100 куб. см. Туда же помещают 20 куб. см 0,2% раствора трифторуксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают и используют для растворения проб перед хроматографированием.

7.2.1.3. Приготовление 1 М раствора гидроокиси натрия.

В мерную колбу на 500 куб. см переносят 20 г гидроокиси натрия, добавляют 200 - 300 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 500 куб. см ацетонитрила и 500 куб. см 0,2%-го раствора трифторуксусной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.3.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией RPA 202248 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг RPA 202248 в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.3.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией RPA 202248 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.2.3.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией RPA 202248 1,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор N 3 хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.2.3.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией RPA 202248 0,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор N 4 хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.2.3.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией RPA 202248 0,2 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор N 5 хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.2.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией RPA 202248 0,1 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной зависимости. Стандартный раствор N 6 хранится в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.2.3.7. Стандартные растворы RPA 202248 с концентрацией 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/куб. см для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 2,5; 1,0; 0,5 и 0,25 мкг/куб. см и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации RPA 202248 в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1 - 2 кап./с).

Патрон Диапак Диол устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см метанола и 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

Из стандартного раствора RPA 202248 в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 1 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с 0,2% раствором трифторуксусной кислоты в соотношении 8:2 и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают 2 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 куб. см гексана и последовательно вносят на патрон. Элюаты собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C и хроматографируют.

Исходный концентратор последовательно обмывают 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 куб. см метанола и последовательно вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой фракции собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с 0,2%-м раствором трифторуксусной кислоты в соотношении 8:2 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие RPA 202248, полноту смывания с патронов и необходимый объем элюента.

Изучение поведения RPA 202248 на концентрирующих патронах Диапак Диол проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. в течение 3 - 4 ч.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 8808-2000 "Масло кукурузное. ТУ", ГОСТ Р 52062-2003 "Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб".

Из пробы кукурузного масла отбирают в стакан навеску массой 10 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 куб. см тремя порциями гексана объемом по 20 куб. см. Экстрагируют RPA 202248 тремя порциями ацетонитрила объемом по 30, 20 и 30 куб. см, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Верхний слой (гексан) отбрасывают.

К масляному остатку в концентраторе, полученному в п. 9.1.1, прибавляют 3 куб. см ацетона, тщательно обмывают стенки концентратора 30 куб. см воды, 5 г хлорида натрия перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Водную фракцию промывают тремя порциями гексана объемом по 20 куб. см каждая, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а водную фракцию собирают в коническую колбу объемом 250 куб. см. Затем содержимое колбы подщелачивают 1 М раствором гидроокиси натрия до pH 9, перемешивают. Водную фракцию возвращают в делительную воронку и промывают одной порцией хлороформа объемом 30 куб. см, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке хлороформ отбрасывают.

Экстрагируют RPA 202248 тремя порциями этилацетата объемом по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (этилацетат) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Далее экстракт подвергают очистке на концентрирующих патронах Диапак Диол.

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 1 куб. см гексана, перемешивают и вносят на заранее подготовленный патрон. Исходный концентратор обмывают 2 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и 10 куб. см гексана и 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1 и последовательно вносят полученные растворы на патрон. Элюаты отбрасывают. Элюируют RPA 202248 10 куб. см метанола, собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с 0,2% раствора трифторуксусной кислотой в соотношении 8:2 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Хроматограф жидкостный Waters 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации N 15311-02 или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм x 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Предколонка стальная Symmetry C8, 20 мм x 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,2%-й раствор трифторуксусной кислоты в соотношении 80:20.

Длина волны: 300 нм.

Время удерживания RPA 202248: 11,414 мин. +/- 2%.

Чувствительность не менее 0,005 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Поскольку молекулярные массы Изоксафлютола и RPA 202248 одинаковы, никаких дополнительных пересчетов не требуется.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Empower2.

Содержание Изоксафлютола рассчитывают по формуле:

A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г (куб. см);

P - содержание RPA 202248 в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., д. 53/1. Телефон: (499)976-37-68, факс: (499)976-43-26.