"МУК 4.1.2688-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств азоксистробина в зеленой массе, семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 1 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств азоксистробина в семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0,02 - 0,2 мг/кг.

Действующее вещество: Азоксистробин.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 403,4.

Метил(Е)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат (IUPAC).

Химически чистое вещество представляет собой бесцветный кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления 116 °C.

Растворимость в воде 6 мг/куб. дм.

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °C): дихлорметан - 400, ацетонитрил - 340, этилацетат - 130, ацетон - 86, толуол - 55, метанол - 20, н-октанол - 1,40.

Область применения: фунгицид системного и контактного действия с длительным защитным эффектом. Ингибирует образование спор и мицеллярный рост. Эффективен против широкого набора патогенов, в том числе возбудителей ложной и настоящей мучнистой росы.

В России для Азоксистробина установлены следующие гигиенические нормативы:

- ПДК в воде - 0,01 мг/куб. дм;

- ПДК в почве - 0,4 мг/кг;

- МДУ в винограде, огурцах, томатах - 0,2 мг/кг;

- ВМДУ в зерне хлебных злаков - 0,2 мг/кг.

R-230310 - Z-геометрический изомер Азоксистробина.

Структурная формула (не приводится).

Метил(2)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)-пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат (IUPAC).

Химически чистое вещество представляет собой кристаллический порошок желтого цвета.

По физико-химическим свойствам R-230310 близок к Азоксистробину.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении азоксистробина и его геометрического изомера методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом в присутствии ацетатного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз и очистки ацетонитрильного экстракта силикагелем с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния.

Идентификация E- и Z- азоксистробина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 20 +/- 5 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку (Acquity BEH C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98%-ной ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Приготовление элюента 1. В коническую колбу с притертой пробкой помещают 75 куб. см гексана и 25 куб. см ацетона. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.

7.2.4. Приготовление элюента 2. В коническую колбу с притертой пробкой помещают 65 куб. см гексана и 35 куб. см ацетона. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.

7.3.1. Основной раствор с концентрациями изомеров по 0,5 мг/куб. см: точные навески азоксистробина и его метаболита (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями по каждому аналиту 0,02, 0,05, 0,1, 0,15 и 0,2 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрациями изомеров по 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 1 куб. см основного раствора и доводят до метки подвижной фазой (5 мкг/куб. см). 4,0 куб. см полученного раствора переносят пипеткой в другую мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Объем вновь доводят до метки подвижной фазой (0,2 мкг/куб. см).

7.3.3. Раствор N 2 с концентрациями изомеров по 0,15 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят пипеткой 7,5 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрациями изомеров по 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят пипеткой 5 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрациями изомеров по 0,05 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят пипеткой 2,5 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрациями изомеров по 0,02 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят пипеткой 1 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения изомеров азоксистробина в семенах, зеленой массе и масле рапса используют ацетонитрильные растворы вещества. Например, раствор внесения с концентрацией изомеров азоксистробина по 0,1 мкг/куб. см готовят из основного раствора с концентрацией изомеров азоксистробина по 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом аналогично п. 7.3.4.

7.4.1. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация изомеров азоксистробина в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации азоксистробина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

Отбор проб семян рапса для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

(10 +/- 0,01) г семян рапса или измельченной зеленой массы помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 10 куб. см воды, 10 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного магния сернокислого и 1 г натрия уксуснокислого. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 мин. и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 мин. Супернатант декантируют и количественно переносят в другую тефлоновую центрифужную пробирку. Если супернатант декантировать не удается, то массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента". Измеряют объем супернатанта или фильтрата и прибавляют к нему силикагель и безводный магний из расчета 50 мг силикагеля, 150 мг магния сернокислого на 1 куб. см супернатанта. При работе с образцами зеленой массы к супернатанту также прибавляют активированный уголь из расчета 7,5 мг на 1 куб. см супернатанта. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате 15 мин. и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 мин. Количественно отбирают с помощью шприца верхний ацетонитрильный слой, переносят его в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем до метки водой. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

10 г масла растворяют в 50 куб. см гексана и пропускают через патрон, заполненный силикагелем 60 и предварительно откондиционированный 2,5 куб. см гексана. Промывают последовательно 25 куб. см гексана и 2 куб. см элюента 1. Фильтрат и промывку отбрасывают. Азоксистробин элюируют 4 куб. см элюента 2. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °C). Остаток растворяют в 10 куб. см смеси ацетонитрил:вода в соотношении 8:2, переносят в центрифужную пробирку и прибавляют 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного магния сернокислого и 1 г натрия уксуснокислого. Дальнейшую обработку проводят так, как это описано для семян в п. 9.1.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 245 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Время удерживания Z-азоксистробина (метаболита) 3,9 +/- 0,1 мин.

Время удерживания E-азоксистробина 4,9 +/- 0,1 мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,02 - 0,2 мкг/куб. см.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание E-азоксистробина в семенах, зеленой массе и масле рапса (X, мг/кг), вычисляют по формуле:

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения азоксистробина, приведенная в табл. 2, (%).

При проявлении на хроматограмме пика Z-азоксистробина (метаболита) его содержание в пробе рассчитывают по этой же формуле. Общее содержание азоксистробина суммируют.

Содержание остаточных количеств азоксистробина или его метаболита в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор азоксистробина с концентрацией 0,2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения азоксистробина или его метаболита в семенах, зеленой массе или масле рапса.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002. "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.