"МУК 4.1.2987-12. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств тиаклоприда в зеленой массе, семенах и масле рапса, ягодах и соке винограда методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.03.2012)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22.12.2012 N 2).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 марта 2012 г.

3. Введены в действие с момента утверждения.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 11.10.2011 N 01.5.04.034/01.00043/2011.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств тиаклоприда в ягодах и соке винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: тиаклоприд.

Структурная формула:

Название действующего вещества по ИЮПАК: (Z)-3-(6-хлор-3-пиридилметил)-1,3-тиазолидин-2-илиденцианамид.

Молекулярная масса: 252,7.

Эмпирическая формула: .

Химически чистое вещество представляет собой желтоватый кристаллический порошок.

Температура плавления: > 270 °C разлагается.

Давление пара: (20 °C).

Растворимость в воде (мг/дм3, 20 °C): 185.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая оральная токсичность (крысы) 836 и 444 мг/кг для особей мужского и женского пола соответственно. Острая дермальная токсичность (крысы) более 2000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на глаза и кожу (кролики). Ингаляционная токсичность (крысы) более 2535 и 1223 мг/м3 соответственно для особей мужского и женского пола. Период наблюдения 4 ч. Не обладает канцерогенным, генотоксичным и мутагенным действием.

Область применения

Инсектицид, используется для обработки листьев яблонь, косточковых фруктовых деревьев, ягод, хлопка, овощей, сахарной свеклы, картофеля, риса и декоративных растений против сосущих и кусающих насекомых, включая смородинную тлю, белокрылку и жужелицу.

В России для тиаклоприда установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,005 мг/кг массы человека;

ОДК в почве - 0,07 мг/кг;

ПДК в воде водоемов - 0,004 мг/дм3;

МДУ - в винограде - 0,02 мг/кг, в плодовых семечковых, семенах и масле рапса - 0,3 мг/кг (данные нормативы вступают в силу после внесения изменений в единые санитарно-гигиенические требования к товарам, подлежащим санитарно-эпидемиологическому контролю в рамках соглашения Таможенного союза по санитарным мерам).

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении тиаклоприда методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции смесью ацетона и воды и очисткой проб перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на концентрирующем патроне, заполненном силикагелем.

Идентификация тиаклоприда проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3.1. Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения иных производителей с аналогичными характеристиками.

3.2. Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанной.

3.3. Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательного оборудования иных производителей с аналогичными техническими характеристиками.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%:

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7.1. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (SunFire C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2. Приготовление растворов

7.2.1. Приготовление 0,005%-го раствора ортофосфорной кислоты: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают (0,5 + 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Перемешивают.

7.2.2. Приготовление 2 М раствора хлорида натрия: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 117 г хлорида натрия. Растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Перемешивают.

7.2.3. Приготовление 0,01 М раствора гидроксида натрия: в мерную колбу вместимостью 1 дм3 помещают 0,4 г гидроксида натрия. Растворяют в 0,5 дм3 бидистиллированной воды и доводят объем до метки. Перемешивают.

7.2.4. Для приготовления подвижной фазы: смешивают ацетонитрил и 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70 по объему, используя мерные цилиндры.

7.2.5. Приготовление элюентов для твердофазной экстракции.

Элюент 1. В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 25 см3 гексана и доводят объем до метки этилацетатом. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.

Элюент 2. В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 гексана и доводят объем до метки этилацетатом. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.

7.3. Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску тиаклоприда (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы тиаклоприда с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 0,75 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему основного раствора подвижной фазы.

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией тиаклоприда 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией тиаклоприда 0,75 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 7,5 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией тиаклоприда 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 5,0 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией тиаклоприда 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 2,0 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией тиаклоприда 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 1,0 см3 раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение месяца, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты определения тиаклоприда в ягодах и соке винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса используют ацетонитрильные растворы тиаклоприда. Растворы с концентрациями 1,0 и 10,0 мкг/см3 готовят из основного раствора с концентрацией 0,5 мг/см3 методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

7.4. Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация тиаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 20 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации тиаклоприда в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

C - аттестованное значение массовой концентрации тиаклоприда в градуировочном растворе;

- результат контрольного измерения массовой концентрации тиаклоприда в градуировочном растворе;

- норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( при P = 0,95).

7.5. Подготовка концентрирующих патронов Силикагель 60

Непосредственно перед употреблением через патрон пропускают 2 см3 элюата 1.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.1979 N 2051-79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Отбор проб винограда производят в соответствии с ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия". Пробы ягод винограда хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение недели.

Для исследовательских целей допускается получение в лаборатории масла из проб измельченных семян рапса методом экстракции органическим растворителем при температуре не выше 40 °C. Пробы масла хранят в холодильнике при 4 °C в закрытой стеклянной таре не более 30 суток.

9.1. Определение тиаклоприда в соке винограда

На воронке Бюхнера фильтруют 20 см3 сока и доводят объем фильтрата до 100 см3 водой. Полученный раствор помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3 и промывают двумя порциями гексана по 25 см3. Органический слой отделяют и отбрасывают. К водному остатку прибавляют 50 см3 2 М раствора хлорида натрия и экстрагируют тиаклоприд 25 см3 хлористого метилена, встряхивая воронку в течение 2 мин. Отделяют нижний органический слой и дважды повторяют экстракцию. Объединенный экстракт промывают 20 см3 0,01 М раствора гидроксида натрия, водный слой отделяют и отбрасывают, а органический пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1,5 см3 этилацетата, прибавляют 0,5 см3 гексана и количественно переносят пробу в подготовленный концентрирующий патрон Силикагель 60. Промывают 8 см3 элюента 1. Промывку отбрасывают. Тиаклоприд элюируют 10 см3 элюента 2. Элюат упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 20 мм3 полученного раствора вводят в хроматограф.

9.2. Определение тиаклоприда в ягодах винограда

В коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают 20 г измельченных ягод, прибавляют 10 см3 воды, 40 см3 ацетона и экстрагируют в течение 10 мин в ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят водой до 100 см3 и далее обрабатывают пробу по п. 9.1.

9.3. Определение тиаклоприда в масле рапса

В коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают 20 г масла и прибавляют 80 см3 гексана. Раствор перемешивают и переносят в делительную воронку. Тиаклоприд экстрагируют тремя порциями по 25 см3 смеси ацетонитрил-вода в объемном соотношении 4:1. Экстракты (нижний слой) объединяют и промывают в делительной воронке двумя порциями по 25 см3 гексана. Промывку отбрасывают. Водноацетонитрильный раствор упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани 40 °C до полного удаления ацетонитрила. Объем водного остатка доводят водой до 100 см3 и далее пробу обрабатывают по п. 9.1.

9.4. Определение тиаклоприда в зеленой массе и семенах рапса

В коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают 20 г измельченной зеленой массы или семян рапса, прибавляют 10 см3 воды и 40 см3 ацетона и экстрагируют в течение 15 мин при температуре 30 °C. Суспензию фильтруют и повторяют экстракцию. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °C до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят водой до 100 см3 и далее обрабатывают пробу по п. 9.1.

9.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Alliance" фирмы Waters с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка SunFire C18 (4,6 x 250) мм, 5 мкм (Waters).

Температура колонки: (30 +/- 1) °C.

Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 30:70.

Скорость потока элюента: 1 см3/мин.

Рабочая длина волны УФ-детектора: 245 нм.

Объем вводимой пробы: 20 мм3.

Время удерживания тиаклоприда: (11,0 +/- 0,2) мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,2 - 2,0 мкг/см3.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание тиаклоприда в ягодах и соке винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

- площадь пика тиаклоприда на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P - навеска анализируемого образца, г;

f - полнота извлечения тиаклоприда, приведенная в табл. 2, %.

Содержание остаточных количеств тиаклоприда в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор тиаклоприда с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

и - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание определяемого компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание тиаклоприда в пробах ягод и сока винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,01 мг/кг - предел обнаружения тиаклоприда в пробах ягод и сока винограда, зеленой массе, семенах и масле рапса.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

X', X, - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

и - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Долженко В.И., Цибульская И.А., Журкович И.К., Луговкина Н.В., Ковров Н.Г. (ГНУ "Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Россельхозакадемии", Санкт-Петербург).