"МУК 4.1.3052-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флуроксипира в семенах и масле рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 05.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 5 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.122/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения в семенах и масле рапса массовой концентрации флуроксипира в диапазоне концентраций 0,01 - 0,08 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Флуроксипир

4-амино-3,5-дихлор-6-фтор-2-пиридилоксиуксусная кислота (IUPAC)

Химически чистый препарат - белое кристаллическое вещество.

Температура плавления: 232 - 233 °С.

Давление пара при 25 °С - 0,126 мПа.

Растворимость при 20 °С, г/л: в воде - 0,091, метаноле - 43,7, ацетоне - 64,7, этилацетате - 11,8, ксилоле - 0,3.

Гигиенические нормативы: ПДК в воде водоемов - 0,01 мг/куб. дм, ОДК в почве - 0,2 мг/кг, МДУ в зерне хлебных злаков, луке - 0,05 мг/кг.

Область применения: гербицид системного ауксиноподобного действия для послевсходовой некорневой обработки против широкого круга широколистных сорных растений (включая подмаренник цепкий и мокрицу-звездчатку) в зерновых, декоративных культурах; против многолетних сорных растений в плодовых садах (включая щавель, вьюнок и другие).

Методика обеспечивает выполнение измерений с погрешностью, не превышающей +/- 25%, при доверительной вероятности 0,95.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

--------------------------------

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20, P = 0,95) приведены в таблице 2.

Метод основан на извлечении остаточных количеств флуроксипира из анализируемого объекта органическими растворителями, проведении очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и метилировании флуроксипира диазометаном. Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки с применением капиллярной газожидкостной хроматографии и использованием детектора электронного захвата.

Нижний предел измерения флуроксипира в пробах семян и масла - 0,01 мг/кг, средняя полнота извлечения из семян - 83,7%, из масла - 81,1%.

Газовый хроматограф с детектором электронного захвата и хроматографической кварцевой капиллярной колонкой длиной 15 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой средней полярности.

Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г, ГОСТ 24104-2001.

Колбы мерные со шлифом объемом 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Микрошприц объемом 10 куб. мм, ТУ 2-833-106.

Пипетки градуированные объемом 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 29227-91.

Пробирки мерные со шлифом объемом 5,0 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Цилиндры мерные объемом 25 и 250 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аналитический стандарт флуроксипира.

Азот газообразный, высокой чистоты, ТУ 301-07-25-89.

Ацетон, особой чистоты, ТУ 2633-004-11291058-94.

Ацетонитрил для хроматографии, химически чистый, ТУ 6-09-4326-76.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, химически чистый, ТУ 6-09-3375-78.

Дихлорметан, химически чистый, ТУ 6-09-2662-77.

Изооктан эталонный, ГОСТ 12433-83.

Калия гидроокись, чистый для анализа, ГОСТ 24363-80.

Натрий сернокислый безводный (сульфат), чистый для анализа, ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, чистый для анализа, ГОСТ 4233-77.

N-Нитрозометилмочевина, химически чистая, ТУ 6-09-11-1643-82.

Серная кислота, особой чистоты, ГОСТ 14262-78.

Смесь н-гексан:диэтиловый эфир, 50:50, по объему.

Эфир диэтиловый, чистый для анализа, ТУ 2600-001-43852015-05.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73.

Ванна ультразвуковая с рабочей частотой 35 кГц.

Вата медицинская, ТУ 9393-001-00302238-97.

Воронки делительные объемом 250 и 500 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Индикаторная бумага универсальная, ТУ 6-09-1181-76.

Колбы-концентраторы объемом 250 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные объемом 100 и 300 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Колпачки алюминиевые для герметизации флаконов, ГОСТ Р 51314-99.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Приспособление для обжима колпачков на флаконах, ТУ 42-2-2442-73.

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Стаканы химические объемом 100, 200 и 500 куб. см, ГОСТ 25336-82

Установка для перегонки растворителей при атмосферном давлении.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Фильтры бумажные, разной степени плотности, ТУ 2642-001-42624157-98.

Флаконы стеклянные (типа пенициллиновых) объемом 2,0, 3,0 и 5,0 куб. см, ТУ 64-2-10-87.

Электроплитка, ГОСТ 14919-83.

Примечание: Допускается применение вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.007-76).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-2009 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 мПа (150 кгс/кв. см) необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздуховодов и газопроводов под давлением", ПБ 03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

Отбор проб семян и масла рапса - ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Для длительного хранения семена рапса подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы семян доводят до стандартной влажности и измельчают. Для исследовательских целей допускается получение в лаборатории масла из проб измельченных семян методом экстракции органическими растворителями при температуре не выше +40 °С. Пробы масла рапса хранят в холодильнике при 0 - 4 °С в закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °С до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

Капиллярную хроматографическую колонку устанавливают в газовый хроматограф и перед анализом кондиционируют при температуре +280 °С до установления нулевой линии.

N-Нитрозометилмочевину массой 0,5 +/- 0,01 г помещают во флакон объемом 2,0 - 3,0 куб. см и герметизируют резиновой пробкой и колпачком с помощью приспособления для обжима колпачков на флаконах. В другой флакон объемом 5,0 куб. см вносят диэтиловый эфир объемом 4,0 куб. см, герметизируют резиновой пробкой и колпачком и охлаждают в морозильной камере холодильника в течение 30 минут.

После этого флаконы через предварительно проколотые пробки соединяют гибкой тефлоновой трубкой (внутренний диаметр ~ 1,5 - 2,0 мм), одним концом погружая ее в диэтиловый эфир на всю глубину (флакон с охлажденным диэтиловым эфиром обязательно должен еще иметь свободный выход в атмосферу). Во флакон с нитрозометилмочевиной, используя шприц с тонкой иглой и прокалывая пробку, добавляют по каплям по стенке 50% водный раствор гидроокиси калия (~ 0,3 куб. см) до прекращения реакции. Диэтиловый эфир при насыщении диазометаном окрашивается в ярко-желтый цвет.

Внимание! Приготовление эфирного раствора диазометана и процедуру метилирования проводят в работающем вытяжном шкафу.

Основной раствор флуроксипира с содержанием 100 мкг/куб. см готовят растворением в ацетоне 0,01 г аналитического стандарта флуроксипира в мерной колбе объемом 100 куб. см. Раствор хранят в холодильнике при температуре +4 - 6 °С не более трех месяцев.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,8; 0,4; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см готовят из основного стандартного раствора флуроксипира последовательным разбавлением ацетоном. Рабочие растворы хранят в холодильнике при температуре +4 - 6 °С не более месяца. В модельных опытах при изучении полноты извлечения флуроксипира используют ацетоновые растворы стандартного вещества.

Для приготовления градуировочных растворов в мерные пробирки со шлифом объемом 5,0 куб. см вносят по 1,0 куб. см рабочих растворов флуроксипира с концентрациями 0,1; 0,2; 0,4 и 0,8 мкг/куб. см. Растворитель в пробирках упаривают в токе азота досуха и проводят метилирование флуроксипира по п. 6.4.1.

6.4.1. Метилирование флуроксипира

В пробирки с сухим остатком добавляют по 2,0 куб. см свежеприготовленного по п. 6.3. эфирного раствора диазометана. Пробирки закрывают пробками и ставят на 12 - 14 часов (на ночь) в холодильник с температурой +4 - 6 °С. После этого диэтиловый эфир в пробирках упаривают в токе азота досуха и сухой остаток растворяют в 2,0 куб. см изооктана.

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм приготовленных по п. п. 6.4 и 6.4.1 растворов, содержащих флуроксипир (в виде производного) в концентрациях 0,1; 0,2; 0,4 и 0,8 мкг/куб. см. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят градуировочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (кв. мм) от концентрации флуроксипира в градуировочном растворе в мкг/куб. см. Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, изменении условий хроматографирования, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

Аналитическую пробу семян массой 10,0 +/- 0,1 г помещают в плоскодонную колбу объемом 300 куб. см, добавляют 150 куб. см ацетона, слегка встряхивают и подвергают обработке в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. при комнатной температуре. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в колбу-концентратор объемом 250 куб. см. Содержимое колбы с пробой промывают 50 куб. см ацетона и также фильтруют в колбу-концентратор.

При использовании аппарата для встряхивания в плоскодонную колбу с аналитической пробой вносят 150 куб. см ацетона и встряхивают в течение 60 минут. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в колбу-концентратор объемом 250 куб. см. Содержимое колбы с пробой промывают 50 куб. см ацетона и также фильтруют в колбу-концентратор.

Колбу-концентратор с объединенным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель до объема 10 - 20 куб. см при температуре +40 °С. В колбу-концентратор добавляют 200 куб. см дистиллированной воды, 2,0 куб. см 5,0% водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре +4 - 6 °С в течение 4 - 5 часов. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку объемом 500 куб. см. В воронку добавляют 10% водный раствор гидроокиси калия до pH 9 - 10, 30 куб. см насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 куб. см дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 15-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 куб. см дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 куб. см насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 куб. см н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний ацетоно-водный слой сливают в химический стакан объемом 500 куб. см, а верхний гексановый слой сливают и отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку объемом 500 куб. см. В воронку добавляют 75 куб. см смеси н-гексан: диэтиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через фильтр со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор объемом 250 куб. см. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 куб. см смеси н-гексан:диэтиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре +40 °С до объема 3 - 5 куб. см. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом объемом 5,0 куб. см и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре +40 °С. Метилирование флуроксипира проводят по п. 6.4.1, а газохроматографический анализ по п. 7.3.

Аналитическую пробу масла массой 10,0 +/- 0,1 г растворяют в 50 куб. см н-гексана (насыщенного ацетонитрилом) в плоскодонной колбе объемом 100 куб. см и после этого гексановый раствор масла переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Колбу промывают 50 куб. см ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и переносят его в воронку. Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний ацетонитрильный слой сливают в колбу-концентратор объемом 250 куб. см. Плоскодонную колбу промывают 25 куб. см ацетонитрила (насыщенного н-гексаном) и также переносят в делительную воронку (250 куб. см). Содержимое воронки встряхивают в течение 2-х минут, отстаивают 5 минут и нижний ацетонитрильный слой объединяют в колбе-концентраторе с предыдущим. Верхний гексановый слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным ацетонитрильным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворитель досуха при температуре +50 °С. Сухой остаток растворяют в 20 куб. см ацетона. К раствору добавляют 200 куб. см дистиллированной воды, 2,0 куб. см 5,0% водного раствора серной кислоты и содержимое колбы перемешивают встряхиванием. Колбу-концентратор помещают в холодильник и выдерживают при температуре +4 - 6 °С в течение 4 - 5 часов. После этого содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку объемом 500 куб. см. В воронку добавляют 10% водный раствор гидроокиси калия до pH 9 - 10, 30 куб. см насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 куб. см дихлорметана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 15-минутного отстаивания нижний дихлорметановый слой сливают и отбрасывают. Процедуру очистки экстракта повторяют с использованием 50 куб. см дихлорметана. Далее в воронку добавляют 40 куб. см насыщенного водного раствора хлористого натрия и после перемешивания 75 куб. см н-гексана. Содержимое воронки энергично встряхивают в течение 2-х минут. После 5-минутного отстаивания нижний водно-ацетоновый слой сливают в химический стакан объемом 500 куб. см, а верхний гексановый слой отбрасывают.

Водный раствор пробы, находящийся в химическом стакане, подкисляют концентрированной серной кислотой до pH 2,0 и переносят в чистую делительную воронку объемом 500 куб. см. В воронку добавляют 75 куб. см смеси н-гексан:диэтиловый эфир (50:50) и встряхивают в течение 2-х минут. После полного разделения слоев нижний водный слой сливают в химический стакан, а верхний гексано-эфирный слой фильтруют через бумажный фильтр со слоем безводного сульфата натрия (толщина слоя ~ 1,0 - 1,5 см) в колбу-концентратор объемом 250 куб. см. Экстрагирование и фильтрование повторяют с использованием 50 куб. см смеси н-гексан:диэтиловый эфир (50:50). Нижний водный слой отбрасывают.

Колбу-концентратор с объединенным гексано-эфирным экстрактом подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и упаривают растворители при температуре +40 °С до объема 3 - 5 куб. см. Остаток экстракта количественно переносят в мерную пробирку со шлифом объемом 5,0 куб. см и упаривают растворители в токе азота досуха при температуре +40 °С. Метилирование флуроксипира проводят по п. 6.4.1, а газохроматографический анализ по п. 7.3.

Газовый хроматограф с детектором электронного захвата и хроматографической кварцевой капиллярной колонкой длиной 15 м, внутренним диаметром 0,32 мм с неподвижной фазой SE-52, толщина пленки 0,4 мкм.

Температура колонки: программирование от 120 °С (1 мин.) до 280 °С (20 мин.) со скоростью 8,0 °С/мин. Температура испарителя - 250 °С, детектора - 300 °С. Расход газов: газа-носителя (азот высокой чистоты) - 1,5 куб. см/мин., дополнительного газа (азот высокой чистоты) к детектору - 40 куб. см/мин. Пробы вводят в инжектор хроматографа в режиме разделения потока газа-носителя 1:10. Количество аликвоты, вводимое в хроматограф, - 1 мкл.

Количественное определение флуроксипира проводят методом абсолютной калибровки, содержание флуроксипира в семенах или масле рапса вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств флуроксипира в анализируемом образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений. При получении зашкаленных пиков анализируемый экстракт разбавляют изооктаном.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: "содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг", где: 0,01 мг/кг - предел обнаружения флуроксипира в анализируемых объектах.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

где:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

где:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 10.