"МУК 4.1.2845-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31.03.2011.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 28.09.2010 N 0045.22.09.10.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в клубнях картофеля в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Название действующего вещества ICIA 5504 по ИЮПАК: Метил(E)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат.

Структурная формула ICIA 5504 (не приводится).

Молекулярная масса: 403,4.

Агрегатное состояние: кристаллический порошок.

Цвет, запах: бесцветный, без запаха.

Плотность: 1,34 г/куб. см (при 20 °C).

Температура плавления: 116 °C.

Растворимость в воде мг/куб. дм (25 °C): при pH 5,2 - 6,2; pH 7,0 - 6,7; pH 9,2 - 5,9.

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °C): ацетон -86; ацетонитрил - 340; гексан - 0,057; дихлорметан - 400; метанол - 20; толуол - 55; этилацетат - 130; н-октанол - 1,40.

Азоксистробин стабилен в водных растворах при pH 5 - 7 при комнатной температуре, в т.ч. при концентрациях менее 1 мкг/кг.

В почве период полураспада 8 недель (лабораторные условия), 2 недели (полевые условия). Основным путем разложения вещества на поверхности почвы является фотолиз (период полураспада 11 дней) с образованием геометрического Z-изомера.

Применяется в России в качестве фунгицида на томатах, огурцах в дозе 0,4 - 0,5 куб. дм/га, винограде в дозе 0,6 - 0,8 куб. дм/га и зерновых в дозе 0,5 - 1,0 куб. дм/га. Проходит регистрационные испытания в России на посадках картофеля в качестве фунгицида с нормой расхода 3,0 куб. дм/га. В России установлены следующие гигиенические нормативы:

- ДСД - 0,03 мг/кг массы человека;

- ПДК в воде водоемов 0,01 мг/куб. дм;

- МДУ в продукции: томаты, огурцы и виноград - 0,2 мг/кг; клубни картофеля - 0,05 мг/кг.

R 230310 - Z-геометрический изомер Азоксистробина.

Название действующего вещества R 230310 по ИЮПАК: (Z)-2-{2-[6-(2-цианофенокси)пиримидин-4-илокси]фенил}-3-метоксиакрилат.

Структурная формула (не приводится).

R 230310 представляет собой кристаллический порошок желтого цвета.

Физико-химические свойства близки к физико-химическим свойствам Азоксистробина.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов клубней картофеля органическим растворителем, очистки экстракта на концентрирующих патронах Диапак С8, Диапак Амин и Диапак С.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак Амин, Диапак С и Диапак С8 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах Диапак Амин, Диапак С и Диапак С8, построение калибровочных кривых.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 500 куб. см ацетонитрила и 500 куб. см очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) - 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг Азоксистробина (ICIA 5504) в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией геометрического изомера Азоксистробина (R 230310) - 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг R 230310 в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 2 используют для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см и помещают в ту же колбу объемом 100 куб. см, доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 1,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор N 4 используется для хроматографического исследования и для построения калибровочной кривой.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 0,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор N 5 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 0,2 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор N 6 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.2.7. Стандартный раствор N 7 с концентрацией Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) по 0,1 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании. Стандартный раствор N 7 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.2.8. Стандартные растворы Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) с концентрацией 2,0, 1,0, 0,4 и 0,2 мкг/куб. см для внесения в образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 2,0, 1,0, 0,4 и 0,2 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0, 0,5, 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. При работе на патронах Диапак С8 используют очищенную воду.

Патрон Диапак С8 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрил-вода в соотношении 1:1 и 10 куб. см воды. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

Из стандартного раствора Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в ацетонитриле, содержащего по 1 мкг/куб. см каждого соединения, отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см воды, перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор сначала обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:5, затем тремя порциями по 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюат упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Элюат после прохождения каждой порции упаривают досуха. Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие Азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310), полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) на концентрирующих патронах Диапак С8 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Соединяют последовательно патроны Диапак Амин (вверху) и Диапак С (внизу), устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующие патроны промывают 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 9:1. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

Из стандартного раствора Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) в ацетонитриле, содержащего по 1 мкг/куб. см каждого соединения, отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну, перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают тремя порциями по 5 куб. см смеси гексана с этилацетатом 3:1 и вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Азоксистробин (ICIA 5504) и его геометрический изомер (R 230310), полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Азоксистробина (ICIA 5504) и его геометрического изомера (R 230310) на концентрирующих патронах Диапак Амин и Диапак С проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry С18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 ч.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" от 21.08.1979 N 2051-79, а также с ГОСТ 27853-88, ГОСТ 13341-77 "Свежие и свежемороженые овощи, картофель, бахчевые, фрукты, ягоды, грибы. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы клубней картофеля хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C.

Образец измельченных клубней картофеля массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 50 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем дополнительно на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют через фильтр "красная лента" в плоскодонную колбу объемом 250 куб. см с 5 г сухого хлористого натрия. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и помещая на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем дополнительно на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракты фильтруют и объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см с хлористым натрием, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 мин. Затем содержимое колбы (без нерастворившейся соли) переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см и выдерживают 5 мин. Выделившуюся нижнюю водную фазу отбрасывают.

К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 куб. см гексана и интенсивно встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а ацетонитрильный слой возвращают в делительную воронку и промывают еще одной порцией гексана объемом 50 куб. см. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 5 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, помещают на 10 с в ультразвуковую ванну, после чего фильтруют через фильтр "красная лента" в концентратор объемом 100 куб. см. Исходный концентратор обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 5 куб. см каждая, объединяют все смывы в концентраторе объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C.

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора и помещая на 5 с в ультразвуковую ванну, прибавляют 9 куб. см воды, тщательно перемешивают и вносят на предварительно подготовленный патрон, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:5, вносят на патрон, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, вносят на патрон, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C и подвергают дальнейшей очистке на патронах Диапак С и Диапак Амин.

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.3, растворяют в 1 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана и вносят на предварительно подготовленные последовательно соединенные патроны Диапак Амин (вверху) и Диапак С (внизу). Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексана с этилацетатом в соотношении 1:3, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Хроматограф жидкостной Waters 515 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации 15311-02 или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм x 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Предколонка стальная Symmetry С18, 20 мм x 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 50:50.

Длина волны: 255 нм.

Время удерживания Азоксистробина (ICIA 5504) - 12,98 - 13,65 мин., его геометрического изомера (R 230310) - 10,27 - 10,69 мин.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Чувствительность 0,003 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Millenium 3.05.01.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Азоксистробина рассчитывают по формуле:

A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г (куб. см);

P - содержание Азоксистробина или R 230310 в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Российский государственный аграрный университет МСХА им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".