"МУК 4.1.3050-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств абамектина в зеленой массе, семенах и масле сои методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 05.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ защиты растений Россельхозакадемии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 5 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации N 01.5.04.125/01.00043/2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации абамектина в зеленой массе, семенах и масле сои в диапазоне концентраций 0,005 - 0,05 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Абамектин.

Структурная формула:

Белый кристаллический порошок без запаха.

Температура плавления: 161,2 - 169,4 °С (с разложением).

Растворимость (в г/куб. дм при 20 °С): вода - 0,00121, гексан 0,11, метанол - 13, толуол - 23, октанол - 83, ацетон - 72, этилацетат - 160, дихлорметан - 470.

Вещество стабильно при нормальных условиях, не гидролизуется в водных растворах при pH 5 - 9.

В биологически активных почвах абамектин прочно связывается и затем быстро разлагается почвенными микроорганизмами.

Область применения препарата. Абамектин - инсекто-акарицид широкого спектра действия, эффективно уничтожает членистоногих, включая клещей и насекомых, на хлопчатнике, сое, овощных и декоративных культурах, семечковых плодовых, картофеле и табаке в течение вегетационного периода.

Гигиенические нормативы для абамектина в России: ОДУ в воде водоемов - 0,001 мг/куб. дм, ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,05 мг/куб. м, ОДК в почве - 0,01 мг/кг, МДУ в огурцах - 0,01 мг/кг; плодовых (семечковых), томатах, перцах, баклажанах, винограде - 0,003 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

Методика основана на определении абамектина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом, очистке экстракта промывкой гексаном и последовательной очистке твердофазной экстракцией.

Идентификация абамектина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Весы аналитические с пределом взвешивания до 210 г и пределом допустимой погрешности 0,2 мг, ГОСТ 24104-2001.

Весы технические с пределом взвешивания до 400 г и допустимой погрешностью 0,1 г, ГОСТ 24104-2001.

Колбы мерные на 10, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Микродозаторы одноканальные переменного объема от 200 до 1000 куб. мм и от 1 до 5 куб. см.

Цилиндры мерные на 50 и 100 куб. см, ГОСТ 23932-90.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Абамектин, аналитический стандарт с содержанием основного компонента 95,0%.

Ацетонитрил, химически чистый, ТУ 6-09-3534-87.

Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная), ГОСТ Р 52501-2005.

н-Гексан, химически чистый, ТУ 6-09-3375-78.

Кислота ортофосфорная, химически чистая, ГОСТ 6552-80.

Кислота уксусная, ледяная, ГОСТ 61-69.

Магний сернокислый безводный, химически чистый, ГОСТ 4523-67.

Метанол, химически чистый, ГОСТ 6995-77.

Натрий уксуснокислый, чистый, ГОСТ 199-68.

Натрий сернокислый безводный, химически чистый, ГОСТ 4166-76.

Смесь N 1: ацетонитрил - вода в соотношении 1:1 по объему.

Смесь N 2: метанол - ацетонитрил в соотношении 1:4 по объему.

Смесь N 3: гексан - этилацетат в соотношении 4:1 по объему.

Смесь N 4: этилацетат - метанол в соотношении 9:1 по объему.

Этилацетат, химически чистый, ГОСТ 1138-84.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм.

Аппарат для встряхивания проб, ТУ 64-1-1081-73

Воронки делительные вместимостью 250 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные конические вместимостью 100 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 10 и 100 куб. см, ГОСТ 9737-93.

Патроны концентрирующие для твердофазной экстракции, 0,4 г гидрофобного сорбента с привитыми гексадецильными группами (патрон N 1), ТУ 4215-002-05451931-94.

Патроны концентрирующие для твердофазной экстракции, 0,4 г слабоосновного анионообменника с привитыми аминогруппами (патрон N 2), ТУ 4215-002-05451931-94.

Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 куб. см.

Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар.

Ультразвуковая ванна с рабочей частотой 35 кГц.

Фильтры бумажные средней плотности, ТУ 6.091678-86.

Центрифуга с максимальной рабочей частотой вращения 4000 об./мин.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 58:42 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см: точную навеску абамектина (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

Градуировочные растворы с концентрациями абамектина 0,04, 0,08, 0,2, 0,5, 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 58:42).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,5 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 5,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,08 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,8 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,04 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,4 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 3 месяцев, градуировочные растворы - в течение недели.

При изучении полноты извлечения абамектина в зеленой массе, семенах и масле сои используют ацетонитрильные растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация абамектина в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации абамектина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

7.5.1. Подготовка патрона для твердофазной экстракции N 1

Патрон N 1 с привитыми гексадецильными группами промывают последовательно 2 куб. см смеси N 2 и 3 куб. см смеси N 1, после чего патрон готов к работе.

7.5.2. Подготовка патрона для твердофазной экстракции N 2

Патрон N 2 с привитыми аминогруппами промывают последовательно 2 куб. см смеси N 4 и 3 куб. см смеси N 3, после чего патрон готов к работе.

Фракции, содержащие абамектин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Фракции, содержащие абамектин, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание: Проверку хроматографического поведения абамектина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Для длительного хранения зерно сои подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы зерна доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла хранят в холодильнике при 0 - 4 °С в закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

9.1.1. Экстракция абамектина из семян сои

Навеску измельченных семян (20 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см и последовательно добавляют 20 куб. см ацетонитрила, 4 г магния сернокислого, 1 г натрия уксуснокислого и 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты. Пробирку плотно закрывают, встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 10 мин. и центрифугируют при скорости 4000 об./мин. в течение 10 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют, фильтруют через бумажный фильтр. К остатку в пробирке добавляют 15 куб. см ацетонитрила и проводят повторную экстракцию. Объединенные ацетонитрильные экстракты очищают по п. 9.2.

9.1.2. Экстракция абамектина из масла сои

Навеску масла (20 г) помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 20 куб. см ацетонитрила и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Затем ацетонитрильный слой осторожно декантируют, к остатку добавляют 15 куб. см ацетонитрила и экстракцию повторяют. Объединенные ацетонитрильные экстракты очищают по п. 9.2.

9.1.3. Экстракция абамектина из зеленой массы сои

Навеску измельченной зеленой массы (10 г) помещают в плоскодонную коническую колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и колбу помещают в ультразвуковую ванну на 10 мин. Затем ацетонитрильный слой осторожно декантируют, пропускают через слой сернокислого натрия, к остатку в колбе добавляют 30 куб. см ацетонитрила и экстракцию повторяют. Объединенные ацетонитрильные экстракты очищают по п. 9.2.

К ацетонитрильному экстракту, полученному по п. 9.1 и помещенному в делительную воронку на 250 куб. см, добавляют 15 куб. см гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 - 3 мин. После полного разделения слоев верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и повторяют операцию очистки с новой порцией гексана объемом 15 куб. см.

Затем ацетонитрильный экстракт переносят в колбу для упаривания на 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Дальнейшую очистку сухого остатка проводят последовательно на патронах N 1 и N 2 по п. 9.3.1 и п. 9.3.2 соответственно.

9.3.1. Очистка на патроне N 1

Остаток в колбе, полученный при упаривании экстрактов п. 9.2, растворяют в 2 куб. см смеси N 1 (ацетонитрил-вода, 1:1) и переносят на подготовленный патрон. Колбу обмывают еще 2 куб. см смеси N 1 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 5 куб. см той же смеси N 1, элюат отбрасывают. Абамектин элюируют 5 куб. см смеси N 2 (метанол-ацетонитрил, 1:4). Элюат количественно переносят в круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Дальнейшую очистку сухого остатка проводят на патроне N 2 по п. 9.3.2.

9.3.2. Очистка на патроне N 2

Остаток в колбе, полученный по п. 9.3.1, растворяют в 1 куб. см смеси N 3 (гексан-этилацетат, 4:1) и переносят на подготовленный патрон. Колбу обмывают еще 1 куб. см смеси N 3 и смыв тоже переносят на патрон. Промывают патрон 8 куб. см той же смеси N 3, элюат отбрасывают. Абамектин элюируют 3 куб. см смеси N 4 (этилацетат-метанол, 9:1). Элюат количественно переносят в круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 58:42) и анализируют на содержание абамектина по п. 9.4.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 58:42. Скорость потока элюента 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны ультрафиолетового детектора 245 нм. Объем дозируемой в хроматограф пробы 10 куб. мм.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание абамектина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств абамектина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор абамектина с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг <*>, где <*> - 0,005 мг/кг - предел обнаружения абамектина в сое).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):