"МУК 4.1.2689-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Разработаны сотрудниками Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

4. Введены в действие с 1 октября 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в ягодах и соке винограда массовой концентрации диметоморфа в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Действующее вещество: Диметоморф.

Структурная формула (не приводится).

Мол. масса: 387,9.

(E,Z)-4-[3-(4-хлорофенил)-3-(3,4-диметоксифенил)акрилоил]морфолин (IUPAC)

(E,Z)-4-[3-(4-хлорофенил)-3-(3,4-диметоксифенил)-1-оксо-2-пропенил]морфолин (CAS).

Растворимость в органических растворителях (мг/куб. дм, 20 °C): н-гексан - 0,11; толуол - 49,5; дихлорметан - 461; метанол - 39; ацетон - 100; этилацетат - 48,3.

Гидролитически и термически стабилен в нормальных условиях. (E)- и (Z)-изомер переходят друг в друга на свету.

Область применения: локальный системный фунгицид, ингибитор образования клеточной стенки грибного оомицета, ингибитор роста и спороношения грибов.

Гигиенические нормативы: ВМДУ диметоморфа в винограде 0,5 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении диметоморфа методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов ацетонитрилом в присутствии ацетатного буфера, насыщенного сульфатом магния, и обеспечивающего разделение водной и органической фаз, и очистки ацетонитрильного экстракта силикагелем с помощью дисперсионной твердофазной экстракции при одновременном удалении воды безводным сульфатом магния.

Идентификация диметоморфа проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.1. При проведении работы необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 20 +/- 5 °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку (Acquity BEH C18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98%-ной ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см: точную навеску диметоморфа (50 +/- 0,5 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем ацетонитрилом до метки).

Градуировочные растворы с концентрациями 0,01, 0,02, 0,05 и 0,1 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50).

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см пипеткой вносят 1 куб. см основного раствора и доводят до метки раствором подвижной фазы (5 мкг/куб. см). Затем 10 куб. см полученного раствора пипеткой переносят в мерную колбу на 100 куб. см и вновь доводят до метки раствором подвижной фазы (0,5 мкг/куб. см). После этого в мерную колбу на 100 куб. см вносят 20 куб. см полученного после второго разбавления раствора и доводят до метки раствором подвижной фазы (0,1 мгк/куб. см).

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,05 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см вносят пипеткой 50 куб. см раствора N 1 и доводят до метки раствором подвижной фазы.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,02 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см вносят пипеткой 40 куб. см раствора N 2 и доводят до метки раствором подвижной фазы.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,01 мкг/куб. см: в мерную колбу на 100 куб. см вносят пипеткой 20 куб. см раствора N 2 и доводят до метки раствором подвижной фазы.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества. Например, раствор внесения с концентрацией диметоморфа 0,1 мкг/куб. см готовят из основного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом аналогично п. 7.3.2.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация диметоморфа в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации диметоморфа в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора. Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не хуже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

Отбор проб винограда производят в соответствии с ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия". Пробы ягод винограда хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы виноградного сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение недели.

Перед проведением анализа пробу отфильтрованного через бумажный фильтр виноградного сока объемом 10 +/- 0,05 куб. см пропускают через концентрирующий патрон Диапак C16. Фильтрат отбрасывают. Диметоморф элюируют 10 куб. см смеси ацетонитрила и воды в соотношении 4:1. Элюат собирают, переносят в тефлоновую центрифужную пробирку и дальнейшую обработку проводят по п. 9.2.

Гомогенизированные пробы ягод винограда массой 10 +/- 0,1 г помещают в тефлоновую центрифужную пробирку вместимостью 50 куб. см, прибавляют 2 куб. см воды, 8 куб. см ацетонитрила, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, 4 г безводного сульфата магния и 1 г уксуснокислого натрия. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 минут и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 минут. Измеряют объем супернатанта и количественно переносят его в другую тефлоновую центрифужную пробирку. Прибавляют силикагель и безводный сульфат магния из расчета 50 мг силикагеля и 150 мг сульфата магния на 1 куб. см супернатанта. Пробирку плотно закрывают пробкой, встряхивают на аппарате в течение 15 минут и центрифугируют при скорости 8000 об./мин. в течение 10 минут. Количественно отбирают с помощью шприца верхний ацетонитрильный слой, переносят его в мерную колбу вместимостью 10 куб. см и доводят объем до метки 0,005 М фосфорной кислотой. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 245 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Время удерживания E-диметоморфа 3,2 +/- 0,1 мин.

Время удерживания Z-диметоморфа 4,5 +/- 0,1 мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,01 - 0,1 мкг/куб. см.

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание диметоморфа в ягодах винограда и виноградном соке (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

K - градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения градуировочной зависимости (мкг/куб. см : кв. мм);

V - объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, куб. см;

P - навеска анализируемого образца, г, для виноградного сока - объем в куб. см;

f - коэффициент извлечения диметоморфа = 100 / полноту определения (приведенную в табл. 2, например, для ягод винограда 100 / 88,7 = 1,13).

Содержание остаточных количеств диметоморфа в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор диметоморфа 0,1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1).

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения диметоморфа в винограде.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.