"МУК 4.1.2768-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имидаклоприда в соке яблок и черной смородины, в масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 17.11.2010)

--------------------------------

<*> Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

Настоящие методические указания устанавливают метод измерения массовой концентрации имидаклоприда в яблочном, смородиновом соке и в кукурузном масле в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Имидаклоприд.

Структурная формула (не приводится).

1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илиденамин (IUPAC).

1-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-N-нитро-2-имидазолидинимин (CAS).

Область применения: Имидаклоприд - системный инсектицид и инсектопротравитель группы неоникотиноидов. Эффективно уничтожает листовую тлю, белокрылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Может использоваться для обработки как почвы, так и надземных органов растений.

Гигиенические нормативы для имидаклоприда в России: ВМДУ имидаклоприда в смородине 0,07 мг/кг, в яблоках 0,5 мг/кг, в кукурузе (зерно) - 0,1 мг/кг.

2.1.1. Принцип метода

Методика основана на определении имидаклоприда методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода определения имидаклоприда достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками не ниже указанных.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ 6829-89 (СТ СЭВ 6534-88) "Смородина черная свежая. Требования при заготовке, поставке и реализации"; ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки"; ГОСТ 13634-90 "Кукуруза. Требования при заготовке и поставках". Пробы яблочного и смородинового сока хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение месяца, в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметичной упаковке в течение недели. Пробы кукурузного масла хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry C-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 ч.

2.5.3. Приготовление растворов

Для приготовления насыщенного раствора хлорида натрия 380 г NaCl растворяют при нагревании в 1000 куб. см дистиллированной воды, полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" и охлаждают до комнатной температуры.

Для приготовления 1 М раствора NaOH 40 г едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см, растворяют при перемешивании в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

Для приготовления 0,025 М раствора NaOH 25 куб. см 1 М раствора едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 20:80 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 куб. см смешивают 500 куб. см н-гексана и 500 куб. см этилацетата.

Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 куб. см смешивают 100 куб. см н-гексана и 900 куб. см этилацетата.

Приготовление основного и рабочих градуировочных растворов

Берут точную навеску имидаклоприда (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил-вода (20:80, по объему).

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения имидаклоприда используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/куб. см готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом. Растворы для внесения в масло готовят из основного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом.

2.5.4. Установление градуировочной характеристики

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация имидаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 20 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента. Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 куб. см элюента N 2 и 30 куб. см элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения имидаклоприда на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 0,1 куб. см стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °C), остаток растворяют в 5 куб. см элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 куб. см элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 120 куб. см элюента N 1, которые отбрасывают, затем 100 куб. см элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание имидаклоприда (п. 2.6.4).

Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют (п. 2.6.4). Рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания имидаклоприда и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.5.7. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

2.6.1. Извлечение имидаклоприда из проб сока яблок и черной смородины

Перед проведением анализа пробу сока объемом 20 куб. см доводят до объема 100 куб. см дистиллированной водой. Пробу помещают в делительную воронку емкостью 500 куб. см и промывают гексаном трижды порциями по 30 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 1 - 2 мин. (верхний органический слой отбрасывают) <*>. Водную фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний органический слой. Объединенный хлористометиленовый экстракт промывают в делительной воронке 0,025 М раствором NaOH дважды порциями по 25 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 1 - 2 мин. и собирая нижний органический слой. Экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 куб. см хлористого метилена. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят на колонке с силикагелем по пункту 2.6.3.

--------------------------------

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку: на стадии промывки экстрактов гексаном - небольшое количество (до 2 куб. см) этилового спирта, а на стадии переэкстракции из водного раствора в хлористый метилен - насыщенный раствор хлорида натрия (15 - 20 куб. см).

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.2. Извлечение имидаклоприда из проб масла кукурузы

Навеску масла массой 20 г помещают в делительную воронку емкостью 250 куб. см и экстрагируют имидаклоприд трижды ацетонитрилом порциями по 30 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний органический слой. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят на колонке с силикагелем по пункту 2.6.3.

Внимание! Отделение ацетонитрильного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.3. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. п. 2.6.1 и 2.6.2 экстрактов растительных материалов количественно переносят двумя порциями смеси гексан-диэтиловый эфир (50:50, по объему) по 5 куб. см каждая в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 100 куб. см элюента N 1 (для проб сока) или 120 куб. см элюента N 1 (для проб масла), которые отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 70 куб. см элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 куб. см. Раствор упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, и 20 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны 268 нм.

Предколонка Symmetry C18 для защиты аналитической колонки.

Колонка Symmetry C18 (250 x 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Температура колонки (30 +/- 1) °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в объемном соотношении 20:80.

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы 20 куб. мм.

Время удерживания имидаклоприда 12,2 +/- 0,2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,0 мкг/куб. см.

2.6.5. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание имидаклоприда в образцах сока или масла (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств имидаклоприда в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор имидаклоприда 2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где:

X - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел определения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88, ГОСТ 12.1.007 и 12.0.004).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03. Помещение должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.