"МУК 4.1.3057-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации хлорэтанола в пробах крови методом капиллярной газовой хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 10.07.2013)

--------------------------------

<*> Свидетельство о метрологической аттестации от 15.12.2011 N 224.0516/01.00258/2011.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газовой хроматографии для измерения массовой концентрации хлорэтанола в пробах крови в диапазоне 0,05 - 10 мкг/куб. см.

Методика предназначена для применения в санитарно-гигиенических, экологических, лечебных и научных организациях, осуществляющих деятельность в области профпатологии и экологии человека.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Хлорэтанол (2-хлорэтанол)

Регистрационный номер CAS 107-07-3

Молекулярная масса 80,51.

Хлорэтанол - бесцветная жидкость с эфирным запахом. Плотность 1,202 г/куб. см, температура кипения 128 °С, температура плавления - 89 °С. Хлорэтанол хорошо растворим в органических растворителях, в воде.

Нормы погрешности измерений массовой концентрации хлорэтанола в пробах крови в нормативной документации не регламентированы.

Методика измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 1.

Значения показателя точности используют:

- при оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;

- при оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;

- при оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

Выполнение измерений массовой концентрации хлорэтанола в экстракте пробы крови проводят методом капиллярной газовой хроматографии с электронно-захватным детектированием. Извлечение и концентрирование хлорэтанола из проб крови проводят методом жидкостно-жидкостной микроэкстракции диэтиловым эфиром с применением высаливания хлоридом натрия с последующим центрифугированием.

Определению не мешают диэтиловый эфир, винилхлорид, 1,2-дихлорэтан, хлороформ.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы.

Примечание: Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание: Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание: Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

6.1. При выполнении работ необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.

6.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

6.3. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2009 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.4. При работе с газовыми баллонами соблюдают правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением, по ПБ 03-576-03.

6.5. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать допустимых значений по ГОСТ 12.1.005-88.

6.6. Организуют обучение работающих безопасности труда по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности.

При выполнении измерений в лаборатории соблюдают следующие условия:

При подготовке к выполнению измерений проводят следующие работы:

Подготовку хроматографа к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации хроматографа.

Используемую посуду необходимо замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте, отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С.

В термостойкий стакан вместимостью 2 куб. дм помещают 50 г дихромата калия, осторожно приливают по палочке частями, тщательно перемешивая, 1 куб. дм концентрированной серной кислоты. Срок хранения - 1 год.

Хроматографическую колонку перед эксплуатацией устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (азота) с расходом 4 куб. см/мин. при температуре 240 °С в течение 2 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе.

Для построения градуировочного графика готовят серию градуировочных растворов хлорэтанола в крови. Для приготовления градуировочных растворов используют свежеприготовленный раствор хлорэтанола в воде (с массовой концентрацией 23 мкг/куб. см) и кровь, не содержащую определяемых компонентов.

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 100 куб. см дистиллированной воды, дозатором вводят 10 куб. мм (эквивалентно 11,85 мг) хлорэтанола, перемешивают, доводят до метки дистиллированной водой и снова тщательно перемешивают. Массовую концентрацию хлорэтанола в основном растворе рассчитывают по формуле (1):

Концентрация хлорэтанола в основном растворе составляет 23 мкг/куб. см. Срок хранения основного раствора хлорэтанола - 24 ч.

Серию образцов для градуировки, состоящую из 5 аттестованных смесей, готовят в мерных пробирках вместимостью 5 куб. см. Для этого в каждую мерную пробирку дозатором вводят основной раствор хлорэтанола в соответствии с табл. 2 и доводят до метки 5 куб. см кровью, не содержащей определяемый компонент.

Срок хранения градуировочных растворов - 24 ч.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади хроматографического пика (Гц · с) от массовой концентрации хлорэтанола (мкг/куб. см) в крови, устанавливают по 6 сериям измерений по 5 концентрациям вещества в каждой серии для каждого диапазона в соответствии с табл. 3.

В две стеклянные хроматографические виалы вместимостью 1,5 куб. см помещают 0,36 г хлористого натрия, 1 куб. см градуировочного раствора, 0,5 куб. см диэтилового эфира. Виалы закрывают пластмассовой завинчивающей пробкой с тефлонированной мембраной (септой), затем помещают в мульти-вортекс и интенсивно перемешивают в течение 5 мин. После перемешивания виалы центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин. После центрифугирования виалы помещают в автоинжектор, который отбирает из виалы 5 мкл верхнего органического эфирного слоя на определенной глубине и вводит в испаритель хроматографа.

Процедуру повторяют аналогично для каждого градуировочного раствора, растворы хроматографируют в условиях:

Температурный режим термостата колонки: 90 °С с выдержкой 1 мин., подъем со скоростью 5 °С/мин. до 130° с выдержкой 1 мин.;

Режим расхода газа-носителя (азота): постоянный поток - 2 куб. см/мин.;

Режим испарителя: температура 160 °С; импульсный ввод 40 p.s.i. 0,75 мин.; деление потока 1:5;

Режим детектора: температура 350 °С, поддув азота 60 куб. см/мин.;

Время удерживания хлорэтанола: 8.850 - 8.900 мин.

На полученных хроматограммах проводят идентификацию определяемого компонента по абсолютному времени удерживания и измеряют площади пика определяемого компонента. Каждую виалу хроматографируют 1 раз. По средним результатам параллельных определений (между двумя виалами) серии образцов для градуировки строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят не реже одного раза в квартал или при смене партии реактивов. Средствами контроля являются вновь приготовленные образцы для градуировки (не менее 2 образцов из приведенных в п. 9.5.2).

Градуировочную характеристику считают стабильной при выполнении для каждого образца для градуировки следующего условия:

где - границы относительной погрешности.

Если условие стабильности градуировочной характеристики не выполняется только для одного образца для градуировки, необходимо выполнить повторное измерение этого образца для исключения результата, содержащего грубую погрешность.

Если градуировочная характеристика нестабильна, выясняют причины и повторяют контроль с использованием других образцов, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики строят новый градуировочный график.

Отбор проб крови в объеме не менее 5 куб. см производится в вакуумные пробирки для забора крови с голубой крышкой. Анализ проб крови проводят непосредственно после отбора проб. Допускается хранение проб в морозильной камере не более 5 дней.

В две стеклянные хроматографические виалы вместимостью 1,5 куб. см помещают по 0,36 г хлористого натрия, 1 куб. см анализируемой пробы крови, 0,5 куб. см диэтилового эфира. Виалу закрывают пластмассовой завинчивающей пробкой с тефлонированной мембраной (септой), затем помещают в мульти-вортекс и интенсивно перемешивают в течение 5 мин. После перемешивания виалу помещают в центрифугу и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин. После центрифугирования виалу помещают в автоинжектор, который отбирает из виалы 5 мкл верхнего органического эфирного слоя на определенной глубине и вводит в испаритель хроматографа. Процедуру повторяют аналогично для второго образца (проводят два параллельных определения).

Хроматографирование проводят в условиях в соответствии с п. 9.6. Определяемый компонент идентифицируют по абсолютному времени удерживания. Абсолютное время удерживания определяемого компонента приведено в п. 9.6.

Для количественного расчета хроматограмм применяют метод абсолютной градуировки.

12.1. На хроматограмме с помощью программы измеряют площадь пика и по градуировочному графику определяют массовую концентрацию хлорэтанола (X, мкг/куб. см).

где r - значение предела повторяемости для двух результатов параллельных определений, % (табл. 3).

где:

Q(0,95;4) - коэффициент, зависящий от числа результатов единичных определений, полученных в условиях повторяемости и доверительной вероятности 0,95:

- среднеквадратическое отклонение повторяемости, % (табл. 1).

12.3. Расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости. При выполнении этого условия приемлемы оба результата измерений и в качестве окончательного может быть использовано их общее среднее значение. Значения предела воспроизводимости приведены в табл. 3.

При превышении предела воспроизводимости могут быть использованы методы оценки приемлемости результатов измерений согласно разделу 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и МИ 2881-2004.

где:

- результат измерений массовой концентрации хлорэтанола, полученный в соответствии с процедурами раздела 12, мкг/куб. см;

- абсолютная погрешность измерений массовой концентрации хлорэтанола, мкг/куб. см, вычисляемая по формуле:

где - относительная погрешность измерений массовой концентрации хлорэтанола, по табл. 1, %;

U - расширенная неопределенность при k = 2, мкг/куб. см, вычисляемая по формуле:

Примечание: числовые значения результата измерений оканчиваются цифрой того же разряда, что и значение показателя точности методики измерений (абсолютной погрешности измерений массовой доли определяемого компонента).

Допустимо результат измерений представлять в виде:

при условии , где - значение показателя точности измерений (доверительные границы абсолютной погрешности измерений), установленное при реализации настоящего метода в лаборатории и обеспечиваемое контролем стабильности результатов измерений.

14.1. Контроль качества результатов измерений в лаборатории предусматривает:

- контроль исполнителем процедуры выполнения измерений;

- контроль стабильности результатов измерений (на основе контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости, среднеквадратического отклонения внутрилабораторной прецизионности, погрешности).

14.2. Контроль исполнителем процедуры выполнения измерений проводят на основе контроля внутрилабораторной прецизионности и погрешности.

При невыполнении условия (8) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (8) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

14.2.2. Контроль погрешности с использованием образцов для контроля (ОК).

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

где - значение характеристики погрешности результатов измерений, соответствующее массовой концентрации определяемого компонента в аттестованной смеси, рассчитанное по формуле:

Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении условия:

При невыполнении условия (12) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (12) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

14.3. Периодичность контроля исполнителем процедуры выполнения измерений, а также реализуемые процедуры контроля стабильности результатов выполняемых измерений регламентируют во внутренних документах лаборатории.