"МУК 4.1.3061-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания флуоксастробина в семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 14.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийский НИИ фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 14.12.2012 N 01.00225/205-76-12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций флуоксастробина в семенах и масле рапса в диапазоне 0,05 - 0,50 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флуоксастробин

Название действующего вещества по ИЮПАК: (1E)-{2-[6-(2-хлорфенокси)-5-фторпиримидин-4-илокси]фенил}(5,6дигидро-1,4,2-диоксазин-3-ил)метанон O-метилоксим

Структурная формула:

Область применения

Флуоксастробин - системный синтетический фунгицид из класса стробилуринов, являющихся продуцентами гриба Strobilurus tenacellus. Механизм его действия связан с подавлением дыхания, приводящего к прекращению прорастания спор и роста мицелия. Вещество обладает защитным и искореняющим действием. При обработке вегетирующих растений в дозах до 200 г/га оно эффективно подавляет развитие возбудителей ржавчины, септориоза, мучнистой росы, ломкости стеблей и пятнистости листьев на посевах ячменя, пшеницы и других культур, а при протравливании семян зерновых колосовых культур в дозах 50 - 100 г/т защищает последние от заражения твердой и пыльной головней и фузариозной корневой гнилью.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в таблице.

Метод основан на экстракции флуоксастробина из семян и масла рапса ацетонитрилом, очистке экстрактов, содержащих флуоксастробин, от коэкстрактивных компонентов гексаном и на колонке с силикагелем, с последующим измерением содержания E- и Z-изомеров флуоксастробина в очищенных экстрактах на жидкостном хроматографе с ультрафиолетовым детектированием и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных средств измерений и устройств аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают вышеуказанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работников правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения хроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,025% уксусная кислота (58:42)

(в объемных соотношениях)

Скорость потока элюента: 0,85 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 250 нм.

Чувствительность: 0,01 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования: (1 - 10) нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление подвижной фазы для метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем.

8.1.1. Очистка ацетона

8.1.2. Очистка этилацетата

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%

Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого в конической колбе растворяют в 40 - 60 куб. см деионизованной воды. Полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

8.1.3. Очистка гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом. Срок хранения - 1 неделя.

8.2.1. Приготовление раствора уксусной кислоты с массовой долей 0,025% (0,025%-й раствор). В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 250 - 300 куб. см бидистиллированной воды, вносят 0,25 куб. см ледяной уксусной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

8.2.2. Приготовление подвижной фазы. В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 580 куб. см ацетонитрила, вносят 420 куб. см 0,025%-ого раствора уксусной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают хроматографическую колонку подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2.2, при скорости подачи растворителя 0,5 куб. см/мин. не менее 2 ч до установления стабильной базовой линии (дрейф базовой линии в течение 1 ч не более 5%, а уровень шумов не более 2% диапазона выходного сигнала на шкале измерений).

8.4.1. Исходные растворы E- и Z-изомеров флуоксастробина для градуировки с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г E- или Z-изомера флуоксастробина, растворяют в 40 - 50 куб. см ацетонитрила, доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение месяца.

8.4.2. Градуировочные растворы E- и Z-изомеров флуоксастробина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор N 1)

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора E- или Z-изомера флуоксастробина с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 8.4.1), раствор разбавляют ацетонитрилом и доводят объем до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N 2 - 5.

Для приготовления проб семян и масла с внесением при оценке полноты извлечения флуоксастробина из исследуемых образцов используют ацетоновые растворы E- и Z-изомеров флуоксастробина с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновые растворы изомеров флуоксастробина хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение месяца.

8.4.3. Градуировочные растворы E- и Z-изомеров флуоксастробина с массовой концентрацией 0,05 - 0,50 мкг/куб. см (растворы N 2 - 5)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 куб. см градуировочного раствора E- или Z-изомера флуоксастробина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 8.4.2), объем доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 8.2, каждый раствор тщательно перемешивают, получают растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией E- и Z-изомеров флуоксастробина 0,05; 0,10; 0,25 и 0,5 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ) от массовой концентрации E- или Z-изомера флуоксастробина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4-м градуировочным растворам (п. 8.4.3).

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 8.4.3) и анализируют при условиях п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных определений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предела повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочные характеристики.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1):

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 20 куб. см этилацетата. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают 20 куб. см этилацетата и 20 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочных растворов E- и Z-изомеров флуоксастробина с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см в ацетонитриле (п. 8.4.2). Раствор упаривают досуха, остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 8.7, элюат отбрасывают. Через колонку пропускают 80 куб. см смеси гексан-этилацетат (6:4, по объему) со скоростью 2 - 3 капли в секунду, отбирая последовательно по 10 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., вносят 2 куб. см подвижной фазы, подготовленной по п. 8.2.2, перемешивают, а затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения изомеров флуоксастробина в каждой из фракций определяют объем смеси гексан-этилацетат (6:4, по объему), необходимый для полного вымывания фунгицида из колонки.

Примечание. Проверку хроматографического поведения флуоксастробина следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания вещества может изменяться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора" и ГОСТ 8988-2002 "Масло рапсовое. Технические условия".

Пробы семян высушивают до стандартной влажности (в соответствии с ГОСТ 10852-86) и хранят в бумажных или тканевых мешочках в течение 6 месяцев в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов. Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре не выше 4 °C.

10.1.1. Семена. Образец размолотых семян массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 50 куб. см ацетонитрила и экстрагируют флуоксастробин на аппарате для встряхивания в течение 20 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок с фильтра количественно переносят в колбу, повторно экстрагируют 40 куб. см ацетонитрила в течение 20 мин. при встряхивании. Суспензию фильтруют и остаток на фильтре промывают 10 куб. см ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость переносят в мерный цилиндр, перемешивают. Переносят 1/2 часть экстракта, эквивалентную 5 г образца, в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 20 куб. см гексана и содержимое интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см через слой безводного сульфата натрия. Объединенную ацетонитрильную фракцию упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 10.2.

10.1.2. Масло. К образцу масла рапса массой 5 г, помещенного в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 50 куб. см ацетонитрила и колбу помещают на 20 мин. на механический встряхиватель. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см через слой ваты, помещенной в конусную воронку. К оставшемуся в колбе маслу приливают 30 куб. см ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 куб. см ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Измеряют объем объединенной ацетонитрильной фракции, отбирают 1/5 объема раствора, эквивалентную 1 г образца, и переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку добавляют 20 куб. см гексана и интенсивно встряхивают в течение 2 мин. Гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильную фракцию фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Далее проводят очистку экстракта на колонке с силикагелем по п. 10.2.

Маслянистый остаток экстрактов семян и масла, полученный по п. 10.1, растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на колонку с силикагелем, подготовленную по п. 8.7. Колбу обмывают 2 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), которые также наносят на колонку. Элюат отбрасывают. Через колонку пропускают 75 куб. см смеси гексан-этилацетат (6:4, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду; отбрасывают первые 25 куб. см элюата и собирают последующие 50 куб. см элюата непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток экстрактов масла и семян растворяют соответственно в 1 и 5 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовленной по п. 8.2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и анализируют на содержание флуоксастробина по п. 11.

Полнота извлечения изомеров флуоксастробина при проведении всех операций подготовки пробы не менее 83% для образцов семян и масла рапса.

11.1. В инжектор хроматографа вводят 20 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (п. п. 10.1 - 10.2), анализируют при условиях (п. 7.2) и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

11.2. Для каждого образца семян и масла повторяют операции по п. п. 10.1 - 10.2, 11.1.

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации "МультиХром для Window", версия 1.5x.

Альтернативная обработка результатов.

По градуировочным характеристикам находят значение массовой концентрации каждого из изомеров флуоксастробина в экстрактах, C, мкг/куб. см.

Массовую долю E- и Z-изомеров флуоксастробина X, мг/кг, в образцах семян и масла рассчитывают по формуле (2):

Общее содержание флуоксастробина в каждой из матриц определяют как сумму массовой доли E- и Z-изомеров вещества.

12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3):

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

12.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона измерений, то результат анализа представляют в виде:

"массовая доля флуоксастробина в семенах, масле менее 0,05 мг/кг".

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал флуоксастробина, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой и анализируют в соответствии с данной методикой.

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 ("Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений"), используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например, при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.