"МУК 4.1.3064-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флудиоксонила в яблоках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 14.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ "Всероссийский НИИ фитопатологии".

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 12.11.2012 N 01.00282-2008/0145.12.11.12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации флудиоксонила в яблоках в диапазоне 2,5 - 10,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флудиоксонил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-(2.2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)-пиррол-3-карбонитрил.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: 

Молекулярная масса: 248,2.

Белое кристаллическое вещество без запаха. Температура плавления: 199,8 °C. Давление паров при 25 °C: . Коэффициент распределения н-октанол/вода: . Растворимость (г/куб. дм) при 25 °C: ацетон - 190, этанол - 44, н-октанол - 20, толуол - 2,7, гексан - 0,008, вода - 0,0018.

Вещество стабильно при температуре до 70 °C и не гидролизуется в диапазоне pH от 5 до 9.

В условиях природного освещения флудиоксонил деградирует с периодом полуисчезновения 9 - 10 дней.

В биологически активных почвах в аэробных условиях флудиоксонил быстро разлагается или переходит в прочносвязанное состояние: .

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность для крыс и мышей > 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность для крыс > 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс > 2600 мг/куб. м. Фунгицид практически нетоксичен для птиц, рыб, пчел, диких животных, червей, дафний и водорослей.

Область применения

Флудиоксонил - контактный фунгицид широкого спектра действия с продолжительной активностью. Высокоэффективен против снежной плесени, твердой головни, гельминтоспориозной и фузариозной корневых гнилей на зерновых злаках, а также ризоктониоза, склеротиниоза, серой гнили и альтернариоза на винограде, косточковых плодовых, овощных и декоративных культурах.

Применяется в России в качестве фунгицида для предпосевного протравливания семян зерновых культур, гороха, подсолнечника и сахарной свеклы, а также для обработки клубней картофеля перед закладкой на хранение с нормой расхода от 5 до 125 г д.в./т.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений не превышает значений, приведенных в табл. 1.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на экстракции флудиоксонила из яблок ацетоном, последовательной очистке экстракта от коэкстрактивных компонентов перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и твердофазной экстракцией, разделении компонентов очищенного экстракта методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с последующим измерением содержания флудиоксонила с использованием ультрафиолетового детектора и обработкой хроматограмм методом абсолютной калибровки.

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.

4.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.

4.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ Р 12.1.019-2009 и инструкцией по эксплуатации прибора.

4.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения хроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Температура воздуха: (20 +/- 5) °C.

Атмосферное давление: 84 - 106 кПа.

Относительная влажность воздуха: не более 80%.

Температура колонки: (20 +/- 5) °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (60:40, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 268 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Время удерживания флудиоксонила: (8,14 +/- 0,2) мин.

Линейный диапазон детектирования: (2 - 20) нг.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ, градуировочных растворов, раствора внесения, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка концентрирующих патронов, проверка хроматографического поведения флудиоксонила на концентрирующем патроне.

7.1.1. Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом. Срок хранения - 1 неделя.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над перманганатом калия и поташом (на 1 куб. дм ацетона 10 г и 2 г ). Срок хранения - 1 неделя.

7.1.3. Очистка хлористого метилена

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%.

Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого растворяют в конической колбе в (100 - 150) куб. см деионизованной воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 500 куб. см и доводят объем раствора до метки деионизованной водой.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

Хлористый метилен промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

7.1.4. Приготовление насыщенного раствора хлорида натрия

В коническую колбу вместимостью 250 куб. см вносят навеску (50 +/- 2) г хлорида натрия, приливают 100 куб. см деионизованной воды, перемешивают в течение 5 мин., полученный раствор фильтруют. Фильтрат является насыщенным раствором хлорида натрия. Срок годности раствора - 1 неделя.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 600 куб. см ацетонитрила, вносят 400 куб. см бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают хроматографическую колонку подвижной фазой для ВЭЖХ, приготовленной по п. 7.2, при скорости подачи растворителя 0,5 куб. см/мин. не менее 2 ч до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Исходный градуировочный раствор флудиоксонила с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают (0,010 +/- 0,0001) г флудиоксонила, растворяют в 30 - 40 куб. см ацетонитрила, доводят объем раствора ацетонитрилом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят при температуре не выше минус 18 °C в течение 3 месяцев.

7.4.2. Градуировочный раствор флудиоксонила с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (раствор N 1).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного градуировочного раствора флудиоксонила с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.4.1), доводят объем раствора до метки ацетонитрилом. Этот раствор используют для приготовления рабочих градуировочных растворов N 2 - 5.

При оценке полноты извлечения флудиоксонила для внесения в образцы используют ацетонитрильные растворы вещества с концентрациями 10 и 50 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и ацетонитрильные растворы флудиоксонила хранят при температуре не выше минус 18 °C в течение месяца.

7.4.3. Градуировочные растворы флудиоксонила с массовой концентрацией 0,1 - 0,4 мкг/куб. см (растворы N 2 - 5).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0; 2,0; 3,0 и 4,0 куб. см градуировочного раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят объем раствора до метки подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 7.2), тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией флудиоксонила 0,1; 0,2; 0,3 и 0,4 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мВ) от концентрации флудиоксонила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 градуировочным растворам (п. 7.4.3).

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 7.4.3) и анализируют при условиях хроматографирования по п. 6.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r. По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Градуировочную характеристику проверяют перед проведением измерения по анализу одного из градуировочных растворов. Если значение площади отличается более чем на 10% от данных, заложенных в градуировочную характеристику, ее строят заново, используя свежеприготовленные рабочие растворы для градуировки.

Концентрирующий патрон N 1 с привитыми октильными группами промывают последовательно с помощью медицинского шприца 3 куб. см ацетонитрила и 5 куб. см смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему) со скоростью 2 - 3 капли в секунду. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

При отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов или растворителей проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания флудиоксонила из патронов.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 40 °C, остаток растворяют в 3 куб. см смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.6. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 2 - 3 капли в секунду. Патрон промывают 4 куб. см смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему), элюат отбрасывают. Затем через патрон пропускают 10 куб. см смеси ацетонитрил-вода (6:4, по объему), отбирая последовательно по 2 куб. см элюата. Каждую фракцию упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухие остатки растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, приготовленной по п. 7.2, помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и растворы хроматографируют в соответствии с п. 6.2.

По результатам обнаружения флудиоксонила в каждой из фракций определяют объем смеси ацетонитрил-вода (6:4, по объему), необходимый для полного вымывания флудиоксонила из патрона.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79) и правилами, определенными ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки".

Образцы яблок хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более суток; для длительного хранения пробы замораживают и хранят при температуре не выше минус 18 °C. Перед проведением анализа плоды измельчают.

Навеску измельченного растительного материала массой 25 г помещают в стакан гомогенизатора вместимостью 500 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетона и гомогенизируют 3 мин. при 10000 об./мин. Гомогенат фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см ацетона. Экстракт и промывную жидкость, объединенные в мерном цилиндре, перемешивают. Измеряют объем раствора, переносят 1/25 его часть (эквивалентную 1 г образца) в круглодонную колбу вместимостью 25 куб. см и упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.1, растворяют в 10 куб. см смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему) и раствор переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. Колбу повторно ополаскивают 10 куб. см смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему), которые также переносят в делительную воронку. В воронку дополнительно вносят 10 куб. см деионизованной воды и 10 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия и раствор перемешивают. К водному раствору приливают 30 куб. см хлористого метилена и содержимое воронки интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний дихлорметановый слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку, в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Операцию экстракции водной фазы повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см дихлорметана. Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 9.3.

Сухой остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 3 куб. см смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Раствор наносят на концентрирующий патрон N 1, подготовленный по п. 7.6. Промывают патрон 4 куб. см смеси ацетонитрил-вода (3:7, по объему), элюат отбрасывают. Флудиоксонил элюируют с патрона 5 куб. см смеси ацетонитрил-вода (6:4, по объему), собирая элюат непосредственно в градуированную пробирку вместимостью 10 куб. см. В градуированную пробирку вместимостью 5 куб. см вносят 1 куб. см полученного элюата, приливают 4 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ, подготовленной по п. 7.2, перемешивают и анализируют на содержание флудиоксонила по п. 10.

10.1. В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (п. п. 9.1 - 9.3), анализируют при условиях п. 6.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

10.2. Для каждого образца яблок повторяют операции по п. п. 9.1 - 9.3, 10.1.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание флудиоксонила (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где - площадь пика флудиоксонила в образце, мВ;

- площадь пика флудиоксонила в стандартном растворе, мВ;

A - концентрация стандартного раствора флудиоксонила, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на концентрирующем патроне и последующего хроматографического определения, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 2,5 мг/кг", где 2,5 мг/кг - предел обнаружения флудиоксонила в анализируемом объекте.

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал флудиоксонила, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 0,4 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ и анализируют в соответствии с данной методикой.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

14.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

14.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

где - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг;

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

14.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

где - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.