"МУК 4.1.3097-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств метомила в капусте, луке, томатах и томатном соке методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 31.07.2013)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России (В.А. Калинин, Т.С. Калинина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 24.04.2012 N 0116.24.04.12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств метомила в капусте, луке, томатах и томатном соке в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: метомил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: S-метил N-[[(метиламино)карбонил]окси]этанимидотиоат.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₅H₁₀N₂O₂S.

Молекулярная масса: 162,2.

Агрегатное состояние: кристаллическое вещество.

Цвет, запах: белое вещество со слабым запахом серы.

Давление паров (при 25 °C): 0,72 мПа.

Температура плавления: 78 - 79 °C.

Коэффициент распределения октанол-вода: K_ow logP_ow = 0,093.

Растворимость в воде (г/дм³, при 25 °C): 57,9.

Растворимость в органических растворителях (г/дм³, при 25 °C): метанол - 1 000; ацетон - 730; этанол - 420; изопропанол - 220; толуол - 30.

Метомил стабилен в воде в течение 30 дней (при pH 5 и 7 и 25 °C); ДТ₅₀ около 30 дней (при pH 9 и 25 °C). Термо- и фотостабилен.

Метомил относится к веществам чрезвычайно опасным по острой оральной (ЛД₅₀ для крыс - 34 мг/кг), умеренно опасным по дермальной (ЛД₅₀ для кроликов более 2 000 мг/кг) токсичностям и чрезвычайно опасным веществам по ингаляционной токсичности (ЛК₅₀ /4 ч/ для крыс 300 мг/м³ воздуха).

Метомил - инсектицид и акарицид из группы карбаматов, ингибитор холинэстеразы желудочно-кишечного действия.

Применяется в России в качестве инсектицида широкого спектра действия для борьбы с вредителями плодовых и цитрусовых культур, винограда, хлопчатника, кукурузы, риса, табака, овощных культур при норме расхода 1 - 2 л/га по препарату.

В России гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

--------------------------------

<*> X - среднее значение массовой концентрации метомила в пробе, мг/кг.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении метомила с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием капиллярной колонки и термоионного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонках с флоризилом.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором колонки и условий программирования.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-90 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать нормы, установленные ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с флоризилом для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с флоризилом, установление градуировочной характеристики.

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/дм³ и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/дм³. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4 000 см³ аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.

В мерную колбу на 1 000 см³ переносят 20 г гидрокарбоната натрия, добавляют 200 - 300 см³ дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения и доводят водой объем в колбе до метки.

Взвешивают 50 мг метомила в мерной колбе объемом 50 см³. Навеску растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов, хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов, установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 30 суток.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 3 используется для приготовления стандартных растворов, установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 7 суток.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 7 суток.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 7 суток.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 1 см³, помещают в мерную колбу объемом 10 см³ и доводят объем до метки ацетоном. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и внесения в контрольные образцы. Раствор может храниться в холодильнике не более 7 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации метомила в растворе (мкг/см³), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 5,0; 2,5; 1,0 и 0,5 мкг/см³.

В испаритель хроматографа вводят по 1 мм³ каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика (мВ) от концентрации метомила в растворе (мкг/см³).

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флоризила с зернением 60/100 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. На слой флоризила наносят слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.

Непосредственно перед использованием колонку промывают 15 см³ ацетона, тщательно отжимают, затем вновь промывают 15 см³ гексана.

В концентратор объемом 100 см³ вносят 1 см³ стандартного раствора метомила в ацетоне с концентрацией 10 мкг/см³ и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют 4 см³ гексана, перемешивают и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C. Исходную колбу обмывают 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, вносят на колонку. Затем колонку последовательно промывают пятью порциями смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:2 объемом 5 см³ каждая. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 см³ ацетона и 1 мм³ пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие метомил, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.

Изучение поведения метомила на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии флоризила.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", от 21.08.79 N 2051-79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51810-01 "Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети", ГОСТ Р 52183-03 "Консервы. Соки овощные. Сок томатный. ТУ", ГОСТ Р 51783-01 "Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. ТУ", ГОСТ Р 51809-01 "Капуста белокочанная свежая, реализуемая в розничной торговой сети", ГОСТ 1724-85 "Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. ТУ".

Пробы томатов, лука и капусты хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °C не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C до 2 лет.

Пробы томатного сока хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более 10 суток.

Образец измельченного растительного материала массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 см³, прибавляют туда 50 см³ ацетонитрила и помещают на аппарат для встряхивания проб на 30 мин. Экстракт фильтруют в делительную воронку объемом 250 см³ через фильтр средней плотности. Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 см³ ацетонитрила и помещая на 15 мин на аппарат для встряхивания проб. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке объемом 250 см³.

К ацетонитрильному экстракту прибавляют 30 см³ гексана и встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний слой (ацетонитрил) возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру еще раз, используя 30 см³ гексана. Нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 см³, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают до водного остатка при температуре не выше 30 °C.

К водному остатку в концентраторе, полученному по п. 9.1.1, прибавляют 50 см³ 2%-го раствора сульфата натрия, тщательно обмывая стенки концентратора, и переносят смыв в делительную воронку объемом 250 см³. Затем концентратор обмывают еще 50 см³ 2%-го раствора сульфата натрия, и все смывы объединяют в делительной воронке.

Метомил экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 50 см³, каждый раз встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) собирают в концентратор объемом 250 см³ через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 см³ хлористого метилена, объединяют смыв с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Далее проводят очистку пробы на колонках с флоризилом.

Сухой остаток, полученный по п. 9.1.2, растворяют в 1 см³ ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, добавляют 4 см³ гексана, перемешивают и вносят на подготовленную колонку. Колонку промывают сначала 10 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, а затем 5 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:2, элюаты отбрасывают. Метомил элюируют с колонки 20 см³ смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:2, элюат собирают в концентратор объемом 100 см³ и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и 1 мм³ раствора вводят в хроматограф.

Навеску томатного сока массой 20 г помещают в делительную воронку объемом 250 см³, добавляют 20 см³ насыщенного раствора хлорида натрия, перемешивают содержимое воронки, приливают 50 см³ ацетонитрила и встряхивают содержимое воронки в течение двух минут. После разделения фаз нижний слой сливают в стакан объемом 100 см³, а ацетонитрил пропускают через безводный сульфат натрия и собирают в концентратор объемом 250 см³. Водно-солевую фазу из стакана возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию метомила в ацетонитрил еще 2 раза, используя каждый раз по 50 см³ ацетонитрила и встряхивая смесь в течение двух минут. Объединенный ацетонитрильный экстракт выпаривают до водного остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Далее проводят очистку экстракта по схеме, указанной в пп. 9.1.2 и 9.1.3.

Сухой остаток растворяют в 1 см³ ацетона и 1 мм³ раствора вводят в хроматограф.

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф газовый с термоионным детектором (ТИД) с пределом детектирования по фосфору в паратион-метиле 3 x 10^-14 г/см³ и снабженный приспособлениями для капиллярной колонки;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая капиллярная из кварцевого стекла, с внутренним диаметром 0,25 мм, длиной 30 м, неподвижной фазой, содержащей 5% дифенила и 95% диметилполисилоксана и толщиной пленки 0,25 мкм.

Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 80 °C, выдержка 1 мин, нагрев колонки по 20 °C в минуту до 150 °C, выдержка 5 мин.

Температура испарителя - 200 °C, детектора - 300 °C.

Регулятор расхода гелия - РРГ-11.

Газ 1 - гелий (газ-носитель), давление на входе - 110 кПа, линейная скорость - 31,188 см/с, давление на выходе - 101,3 кПа, поток через колонку - 1,246 см³/мин, мертвое время - 1,60 мин.

Газ 2 - гелий (сброс пробы), режим - сплитлесс, расход во время анализа - 20 см³/мин, деление потока - 1:30, начало сброса - 30 с, длительность сброса - 2 мин.

Газ 4 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 35 см³/мин.

Газ 5 - водород, расход во время анализа - 11,0 см³/мин.

Газ 6 - воздух, расход - 200 см³/мин.

Продувка детектора и испарителя азотом после анализа - по 50 см³/мин в течение 3 мин при температуре колонки 250 °C. Расход газов: Г1 - 50; Г2 - 40; Г4 - 40 см³/мин.

Объем вводимой пробы: 1 мм³.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 0,5 - 5,0 нг.

Содержание метомила в пробах капусты, лука, томатов и томатного сока рассчитывают по формуле:

где X - содержание метомила в пробе, мг/кг;

S_ст - высота (площадь) пика стандарта, мВ;

S_пр - высота (площадь) пика образца, мВ;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г (см³);

P - содержание метомила в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,025 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> - 0,025 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 - 6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для метомила проводят в начале и по окончании каждой серии анализов, а также при смене основных градуировочных растворов:

- N 1 - каждые 4 месяца;

- N 2 - каждый месяц;

- N 3, 4, 5 и 6 - каждые 7 дней.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание метомила в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,5 до 5 мкг/см³.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация метомила контрольного измерения, мкг/см³;

C - известная концентрация градуировочного раствора метомила в ацетоне, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см³;

6,62 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 6,62%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов метомила, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки C_д должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры К_к рассчитывают по формуле:

где , , C_д - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.