"МУК 4.1.2865-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии"
(утв. Роспотребнадзором 31.03.2011)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 28.12.2010 N 3).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 марта 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики от 25.06.2010 N 01.5.04.686.

Настоящий документ устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Фенпропидина в зеленой массе и зерне зерновых культур в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг и в соломе в диапазоне 0,04 - 0,4 мг/кг.

Действующее вещество: Фенпропидин.

Структурная формула (не приводится).

Название действующего вещества по ИЮПАК: (RS)-1-[3-(4-трет-бутилфенил)-2-метилпропил]пиперидин.

Молекулярная масса: 273,5.

Химически чистое вещество представляет собой бледно-желтую слегка вязкую жидкость без запаха.

Температура кипения > 250 °С, 70,2 °С/1,1 Ра.

Давление пара 17 мРа (25 °С).

Растворимость в воде (мг/куб. дм, 25 °С): 530 (рН 7); 6,2 (рН 9).

Не обладает мутагенным, канцерогенным и тератогенным действием.

Область применения: Фенпропидин - лиственный фунгицид системного действия с целебным защитным и искореняющим эффектом. Подавляет развитие таких заболеваний зерновых культур, как ложномучнистая роса, ржавчина и пятна на листьях, вызываемые, соответственно, грибами из родов Erysiphe graminis, Puccinia SPP и Rhynchosporium secalis.

Гигиенические нормативы в России для фенпропидина: МДУ в зерне хлебных злаков 0,25 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Методика основана на определении Фенпропидина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его экстракции из образцов смесью органического растворителя с водой и очистки экстракта путем перераспределения кислотно-основных форм Фенпропидина между двумя несмешивающимися фазами и методом твердофазной экстракции.

Идентификация Фенпропидина проводится по времени удерживания, количественное определение - методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов квалификацией не ниже указанных.

Допускается использование другого вспомогательного оборудования с техническими характеристиками не хуже указанных.

4.1. При работе необходимо соблюдать требования техники безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.1.007). Организация обучения работников безопасности труда - ГОСТ 12.0.004.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны".

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха 20 +/- 5 °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Перед началом анализа колонку (Acquity ВЕН С18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии.

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: 0,5 +/- 0,01 г 98% ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60 по объему, используя мерные цилиндры.

7.2.3. Приготовление элюента для твердофазной экстракции. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 20 куб. см ацетона и доводят объем до метки гексаном. Перемешивают. Элюент хранят в вытяжном шкафу и используют свежеприготовленным.

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см: точную навеску Фенпропидина (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления основного раствора по объему, используя подвижную фазу.

7.3.2. Раствор N 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 100 куб. см вносят 0,2 куб. см основного раствора и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.3. Раствор N 2 с концентрацией 0,75 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см вносят 7,5 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.4. Раствор N 3 с концентрацией 0,5 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 5 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.5. Раствор N 4 с концентрацией 0,2 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 2,0 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

7.3.6. Раствор N 5 с концентрацией 0,1 мкг/куб. см: в мерную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 1 куб. см раствора N 1 и доводят объем до метки подвижной фазой.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе пшеницы используют ацетонитрильные растворы вещества.

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика - концентрация Фенпропидина в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации Фенпропидина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (К) в уравнении линейной регрессии:

где S - площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

Непосредственно перед употреблением через патрон, заполненный силикагелем, пропускают 2,5 куб. см гексана.

Отбор проб зерна производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна". Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Перед анализом зерно и солому измельчают на лабораторных мельницах.

20 г зерна или измельченной зеленой массы или 5 г соломы помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см и экстрагируют 75 куб. см смеси ацетона и воды в соотношении 7:3 в ультразвуковой бане в течение 15 мин. Массу фильтруют на воронке Бюхнера через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют с тем же объемом экстрагента. Объединенный экстракт упаривают на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят до 80 куб. см, подкисляют 1 М раствором хлористоводородной кислоты до pH 3,0 и промывают дважды по 25 куб. см гексана. Гексановый экстракт отбрасывают. К отделенному водному слою прибавляют около 5 куб. см 1 М раствора гидроксида натрия до pH 9,0 и экстрагируют фенпропидин трижды по 25 куб. см гексана. Экстракт фильтруют через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2,0 куб. см гексана и вносят в откондиционированный патрон, заполненный силикагелем. Патрон промывают 2 куб. см гексана. Промывку отбрасывают. Фенпропидин элюируют 2 куб. см элюента, приготовленного по п. 7.2.3. Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм полученного раствора вводят в хроматограф.

Ультраэффективный жидкостной хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка ACQUITY UPLC ВЕН С18 (2,1 х 100) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки (30 +/- 1) °С. Подвижная фаза: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 40:60. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 220 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм.

Время удерживания Фенпропидина 4,7 +/- 0,1 мин.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в интервале концентраций 0,1 - 1,0 мкг/куб. см.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание Фенпропидина в зеленой массе, зерне и соломе пшеницы (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств Фенпропидина в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор Фенпропидина с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где:

Х - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг.

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения Фенпропидина в зеленой массе и зерне пшеницы).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, г. Санкт-Петербург.

Методика прошла метрологическую экспертизу (Свидетельство об аттестации N 01.5.04.2.015.25.11.09 от 26.11.09).