"МУК 4.1.3059-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение остаточного содержания тебуконазола в семенах и масле льна методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 14.07.2013)

1. Разработаны сотрудниками ГНУ Всероссийского НИИ фитопатологии.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 14 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 14.12.2012 N 01.00225/205-79-12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций тебуконазола в семенах и масле льна в диапазоне 0,3 - 3,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: тебуконазол.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (RS)-1-п-хлорфенил-4,4-диметил-3-(1H-1,2,4-триазол-1-илметил)пентан-3-ол.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 307,8.

Бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления: 105 °C. Давление паров при 20 °C: мПа. Коэффициент распределения н-октанол/вода: . Растворимость (г/куб. дм) при 20 °C: дихлорметан - более 200, изопропанол, толуол - 50 - 100, гексан - менее 0,1, вода - 0,036.

Вещество устойчиво к гидролизу при pH 5 - 9 и фотолизу.

Тебуконазол медленно разрушается в почве и слабо передвигается по почвенному профилю.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность для крыс и мышей - 3000 мг/кг; острая дермальная токсичность для крыс - более 5000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс - 5100 мг/куб. м воздуха. Тебуконазол вызывает слабое раздражение слизистой оболочки глаз у кроликов. для рыб 5,7 мг/куб. дм (96 ч).

Фунгицид нетоксичен для птиц, пчел, дождевых червей и водорослей.

Область применения препарата. Тебуконазол - системный фунгицид широкого спектра действия с защитным, лечебным и искореняющим эффектом. Активен против возбудителей мучнистой росы, ржавчины, септориоза, фузариоза, ринхоспориоза на зерновых злаках, альтернариоза и склеротиниоза на рапсе. В России применяется для обработки вегетирующих растений зерновых злаков и рапса в дозах до 250 г д.в. на 1 га, а также для протравливания семян в дозах до 30 г д.в. на 1 т. Используется тебуконазол также в качестве составного компонента смесевых препаратов.

При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значение погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышает значений, приведенных в таблице.

Метод основан на экстракции тебуконазола из семян и масла льна ацетонитрилом, очистке экстрактов, содержащих тебуконазол, от коэкстрактивных компонентов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с флоризилом, с последующим измерением содержания тебуконазола методом капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) при программировании температуры с термоионным детектором (ТИД) и обработкой хроматограмм методом абсолютной градуировки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.

Примечание. Допускается использование других вспомогательных средств измерений и устройств аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают вышеуказанным, а также материалов, обеспечивающих нормативы точности при проведении измерений.

5.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами, по ГОСТ 12.1.007-76, 12.1.005-88.

5.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают требования противопожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и должны быть в наличии средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-90. Обучение работающих правилам безопасности труда проводят согласно ГОСТ 12.0.004-90.

5.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5.4. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

К выполнению измерений и обработке результатов допускается специалист, прошедший обучение, имеющий опыт работы в лаборатории и владеющий техникой проведения газохроматографического анализа, освоивший данную методику и подтвердивший соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с флоризилом.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до прекращения окрашивания последней в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%

Навеску (5 +/- 0,1) г натрия углекислого растворяют в конической колбе в 40 - 60 куб. см дистиллированной воды. Полученный раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора - 1 неделя.

Этилацетат промывают последовательно раствором натрия углекислого с массовой долей 5%, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют. Срок хранения - 1 неделя.

Капиллярную кварцевую колонку устанавливают в термостат хроматографа и, не подсоединяя к детектору, кондиционируют при температуре 290 °C и скорости газа-носителя 2 куб. см/мин. в течение 8 - 10 ч.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помешают (0,010 +/- 0,0001) г тебуконазола, растворяют в 40 - 50 куб. см этилацетата, доводят объем этилацетатом до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят при температуре не выше (-18) °C в течение 3 месяцев.

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного градуировочного раствора тебуконазола с массовой концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 8.3.1), разбавляют смесью гексан-этилацетат (8:2, по объему) и доводят объем этим же раствором до метки. Этот раствор используют для приготовления градуировочных растворов N (2 - 5).

Для приготовления проб семян и масла с внесением при оценке полноты извлечения тебуконазола из исследуемых образцов используют ацетоновый раствор тебуконазола с концентрацией 10 мкг/куб. см.

Градуировочный раствор N 1 и ацетоновый раствор тебуконазола хранят при температуре не выше (-18) °C в течение месяца.

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора N 1 тебуконазола с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 8.3.2), доводят объем раствора до метки смесью гексан-этилацетат (8:2, по объему), тщательно перемешивают, получают градуировочные растворы N 2 - 5 с массовой концентрацией тебуконазола 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

Растворы готовят непосредственно перед использованием.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (мкВ) от концентрации тебуконазола в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной градуировки по 4 градуировочным растворам.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора (п. 8.3.3) и анализируют при условиях хроматографирования по п. 7.2. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Расхождение между параллельными определениями не должно превышать предел повторяемости r.

По полученным данным строят градуировочную характеристику.

Контроль стабильности градуировки проводят не реже 1 раза в три месяца, а также при смене реактивов или изменении условий анализа.

Для контроля стабильности используют вновь приготовленные градуировочные растворы с массовой концентрацией исследуемого вещества в начале, середине и в конце диапазона измерений, которые анализируют в точном соответствии с методикой.

Градуировочную характеристику считают стабильной, если для каждого контрольного образца выполняется условие (1):

где:

, - значение площади пика тебуконазола в образце для контроля, измеренное и найденное по градуировочной характеристике соответственно, мкВ;

- норматив контроля, , где

- границы относительной погрешности, % (табл. 1).

Если условие стабильности не выполняется только для одного образца, то повторно анализируют этот образец для исключения результата, содержащего грубую ошибку.

Если градуировка нестабильна, выясняют причины нестабильности и повторяют контроль стабильности с использованием других образцов для градуировки, предусмотренных методикой. При повторном обнаружении нестабильности градуировки прибор градуируют заново.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 8 - 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г флоризила в 15 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии флоризила проводят определение объема элюента, необходимого для полного вымывания тебуконазола из колонки с флоризилом.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,1 куб. см градуировочного раствора тебуконазола с массовой концентрацией 10 мкг/куб. см в смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 40 °C. Остаток растворяют в 3 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и раствор наносят на колонку с флоризилом, подготовленную по п. 8.6. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Затем через колонку с флоризилом пропускают 50 куб. см смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему), отбирая последовательно фракции элюента по 10 куб. см. Каждую фракцию упаривают досуха, остатки растворяют в 1 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., а затем хроматографируют в соответствии с п. 7.2.

По результатам обнаружения тебуконазола в каждой из фракций определяют объем элюента, необходимый для полного вымывания тебуконазола из колонки.

Отбор проб производят в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) и правилами, определенными ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб" и ГОСТ 5791-81 "Масло льняное техническое. Технические условия". Семена льна хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Льняное масло хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре не более 6 месяцев.

Навеску измельченного растительного материала массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 50 куб. см ацетонитрила и помещают на аппарат для встряхивания на 40 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу Бунзена вместимостью 250 куб. см. Осадок на фильтре промывают 30 куб. см ацетонитрила. Экстракт и промывную жидкость переносят в химический стакан, перемешивают, измеряют объем раствора и 1/2 его часть (эквивалентную 5 г образца) переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. см. В воронку вносят 10 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см через слой ваты, помещенной в конусную воронку. Вату на фильтре промывают 10 куб. см ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фракцию упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Далее проводят очистку экстракта по п. 10.3.

Навеску льняного масла массой 5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 50 куб. см ацетонитрила и помещают на аппарат для встряхивания на 20 мин. Верхний ацетонитрильный слой декантируют в химический стакан вместимостью 250 куб. см через слой ваты, помещенной в конусную воронку. К оставшемуся в колбе маслу приливают 30 куб. см ацетонитрила и операцию экстракции повторяют. После декантации ацетонитрильного слоя вату промывают 10 куб. см ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Объединенную ацетонитрильную фазу помещают в морозильник холодильника на 3 ч и затем фильтруют через вату в химический стакан. Вату промывают 10 куб. см ацетонитрила, которые объединяют с фильтратом. Фильтрат переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 15 куб. см гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой фильтруют через слой безводного сульфата натрия в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, упаривают до маслянистого остатка на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по п. 10.3.

Маслянистые остатки в круглодонных колбах, полученные по пп. 10.1 и 10.2, растворяют в 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин. Отбирают 2 куб. см полученного раствора и наносят на колонку, подготовленную по п. 8.6. Промывают колонку 40 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, элюат отбрасывают. Тебуконазол элюируют с колонки 40 куб. см смеси гексан-этилацетат (4:6, по объему), собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу вместимостью 100 куб. см. Раствор упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухие остатки экстрактов семян и масла растворяют в 6 куб. см смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая в ультразвуковую ванну на 1 мин., и раствор анализируют на содержание тебуконазола по п. 11.1.

Полнота извлечения тебуконазола при проведении всех операций подготовки пробы не менее 87%.

11.1. В испаритель хроматографа вводят 1 куб. мм очищенного экстракта анализируемой пробы (пп. 10.1 - 10.3), анализируют при условиях п. 7.2 и регистрируют хроматограмму. Каждый экстракт хроматографируют дважды.

11.2. Для каждого образца семян и масла льна повторяют операции по пп. 10.1 - 10.3, 11.1.

12.1. Для обработки результатов хроматографического анализа используют программу сбора и обработки хроматографической информации.

Альтернативная обработка результатов.

По градуировочной характеристике находят значение массовой концентрации тебуконазола в экстрактах, C, мкг/куб. см.

Массовую долю тебуконазола X, мг/кг, в семенах и масле льна рассчитывают по формуле (2):

где:

C - значение массовой концентрации тебуконазола в экстрактах, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемой части образца, соответствующая доле экстракта, использованной для очистки на колонке с флоризилом и последующего хроматографического определения, r;

0,87 - коэффициент извлечения тебуконазола, учитывающий все процедуры подготовки пробы.

12.2. За результат измерений принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости (3):

где:

, - результаты параллельных определений массовой доли тебуконазола, мг/кг;

r - значение предела повторяемости, % (табл. 1).

Если условие (3) не выполняется, выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и повторяют выполнение измерений в соответствии с требованиями МВИ.

12.3. Результат анализа в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

где:

- среднее арифметическое значение результатов n определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- границы относительной погрешности измерений, % (табл.).

В случае, если полученный результат измерений ниже нижней границы диапазона измерений, то результат анализа представляют в виде:

"массовая доля тебуконазола в семенах, масле менее 0,3 мг/кг".

Экстракты, при хроматографировании которых получают аналитический сигнал тебуконазола, превышающий аналитический сигнал, получаемый при хроматографировании градуировочного раствора с массовой концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют смесью гексан-этилацетат (8:2, по объему) и анализируют в соответствии с данной методикой.

13.1. Проверку приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости проводят:

а) при возникновении спорных ситуаций между двумя лабораториями;

б) при проверке совместимости результатов измерений, полученных при сличительных испытаниях (при проведении аккредитации лабораторий и инспекционного контроля).

13.2. Для проведения проверки приемлемости результатов измерений в условиях воспроизводимости каждая лаборатория использует пробы, оставленные на хранение.

13.3. Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где:

, - результаты измерений массовой доли тебуконазола, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости, % (при этом ).

Если предел воспроизводимости не превышен, то приемлемы все результаты измерений и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. Если предел воспроизводимости превышен, то выполняют процедуры, изложенные в ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.3).

При разногласиях руководствуются ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 (п. 5.3.4).

Контроль качества результатов измерений в лаборатории при реализации методики осуществляют по ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002, используя контроль стабильности среднеквадратического (стандартного) отклонения повторяемости по п. 6.2.2 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 и показателя правильности по п. 6.2.4 ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

Рекомендуется устанавливать контролируемый период так, чтобы количество результатов контрольных измерений было от 20 до 30.

При неудовлетворительных результатах контроля, например при превышении предела действия или регулярном превышении предела предупреждения, выясняют причины этих отклонений, в том числе проводят смену реактивов, проверяют работу оператора.