"МУК 4.1.2779-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Пикоксистробина в воде, почве, зерне и соломе зерновых культур, зеленой массе и корнеплодах сахарной свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.11.2010)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 14.10.2010 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 ноября 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики 0047.22.09.10 от 28.09.2010.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Пикоксистробина в воде в диапазоне 0,005 - 0,05 мг/куб. дм и в почве в диапазоне 0,1 - 1,0 мг/кг, а также уровня остаточных количеств в зерне зерновых культур в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, в соломе зерновых культур в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг, в зеленой массе сахарной свеклы в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг и в корнеплодах сахарной свеклы в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Название действующего вещества по ИЮПАК:

Метил (Е)-3-метокси-2-[2-(6-трифторметил-2-пиридилоксиметил) фенил]акрилат.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 367,3.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: от белого до светло-бежевого цвета без запаха.

Температура плавления: 75 °С.

Растворимость в воде, мг/куб. дм (20 °С): 3,1.

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °С): метанол - 96; 1,2-дихлорэтан, ацетон, ксилол, этилацетат - более 250.

Устойчив к гидролизу в диапазоне pH 5 - 7.

Область применения: Пикоксистробин - фунгицид защитного, ограниченно системного действия, применяется для борьбы с широким спектром заболеваний, вызываемых ложномучнисторосяными и мучнисторосяными грибами.

Предлагается в России в качестве фунгицида в посевах зерновых колосовых культур при норме расхода 120 г д.в./га.

В России для Пикоксистробина установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,04 мг/кг массы человека; ОБУВ в атмосферном воздухе - 0,01 мг/куб. м; ОДК в почве - 0,4 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,03 мг/куб. дм; МДУ в зерне хлебных злаков - 0,2 мг/кг, в корнеплодах сахарной свеклы - 0,05 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Пикоксистробина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами на колонках с окисью алюминия и концентрирующих патронах Диапак С16.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия, концентрирующих патронов Диапак Амин и Диапак С16 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак Амин и Диапак С16, установление градуировочной характеристики.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °С, отбрасывают.

7.7.2. Очистка ацетона

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °С, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 часов.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °С, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °С, отбрасывают.

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 600 куб. см ацетонитрила и 400 куб. см очищенной воды. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту. Готовый раствор подвижной фазы хранят при комнатной температуре не более 7 суток.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Пикоксистробина 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг Пикоксистробина в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Пикоксистробина 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для внесения в контрольные образцы и для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Пикоксистробина 1,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Стандартный раствор N 3 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Пикоксистробина 0,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Стандартный раствор N 4 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Пикоксистробина 0,2 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и для внесения в контрольные образцы. Стандартный раствор N 5 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией Пикоксистробина 0,1 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 6 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.2.7. Стандартные растворы с концентрацией Пикоксистробина 5,0; 2,5; 2,0 и 0,4 мкг/куб. см для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,5; 2,0 и 0,4 мкг/куб. см, и используют эти растворы с целью внесения в контрольные образцы. Стандартные растворы для внесения в контрольные образцы хранятся в холодильнике не более 30 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Пикоксистробина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см ацетонитрила.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения Пикоксистробина на колонке с окисью алюминия

В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Пикоксистробина в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Исходную колбу обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы объемом по 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие Пикоксистробин, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Пикоксистробина на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.

7.5.1. Подготовка концентрирующих патронов Диапак Амин для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1 - 2 кап./с).

Патрон Диапак Амин устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 куб. см смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:9. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения Пикоксистробина на патроне Диапак Амин

В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Пикоксистробина в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, добавляют 9 куб. см гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят раствор на патрон. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

Исходную колбу обмывают еще двумя порциями смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:9 объемом по 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на патрон. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы объемом по 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие Пикоксистробин, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Пикоксистробина на концентрирующих патронах Диапак Амин проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

7.6.1. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С16 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1 - 2 кап./с).

Патрон Диапак С16 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой соотношении 2:1, затем 20 куб. см воды. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.6.2. Проверка хроматографического поведения Пикоксистробина на концентрирующих патронах Диапак С16

Из стандартного раствора Пикоксистробина в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см воды, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают последовательно двумя порциями по 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, затем 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2, затем двумя порциями по 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:1, полученные растворы последовательно вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие Пикоксистробин, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Пикоксистробина на концентрирующих патронах Диапак С16 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Zorbax Eclipse XDB-С8 или Simmetry С18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 часа.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.1979, а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 17.4.3.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна", ГОСТ 27262-87 "Корма растительного происхождения. Методы отбора проб" и ГОСТ Р 52647-2006 "Свекла сахарная. ТУ".

Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °С; пробы почвы - в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °С.

Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Пробы зеленой массы и корнеплодов сахарной свеклы хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С.

9.1.1. Экстракция

Пробу воды объемом 100 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют туда 5 г хлористого натрия и перемешивают до полного растворения соли. Пикоксистробин экстрагируют тремя порциями гексана объемом по 30 куб. см, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, собирая его через слой безводного сульфата натрия. Экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.2. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на заранее подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см. Исходную колбу обмывают 10 куб. см ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют в концентраторе и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 5 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.2.1. Экстракция

Пробу почвы весом 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют туда 10 куб. см воды и выдерживают 10 минут при комнатной температуре. Пикоксистробин экстрагируют 75 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 9:1 в течение 10 минут на аппарате для встряхивания. Затем пробу центрифугируют в течение 5 минут при скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют в коническую колбу объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 75 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 9:1 и помещая каждый раз на 10 минут на аппарат для встряхивания. Пробы центрифугируют, фильтруют, экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 минут при комнатной температуре.

Объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см (нерастворившуюся соль оставляют в колбе), оставляют до полного разделения слоев и нижний (водный) слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, прибавляют 5 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки колбы, затем прибавляют 100 куб. см дистиллированной воды, 5 г хлорида натрия, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см.

Пикоксистробин экстрагируют тремя порциями гексана объемом по 30 куб. см, каждый раз встряхивая делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) собирают в коническую колбу объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия.

Затем гексановый экстракт переносят в чистую делительную воронку объемом 250 куб. см и экстрагируют Пикоксистробин тремя порциями ацетонитрила объемом по 30 куб. см, каждый раз встряхивая делительную воронку по 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний (ацетонитрильный) слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °С.

9.2.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак С16

Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила и очищают на колонке с окисью алюминия, как указано в п. 9.1.2. Элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С и подвергают дальнейшей очистке на концентрирующих патронах Диапак С16.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см воды, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, затем 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2. Растворы наносят на патрон и элюаты также отбрасывают. Пикоксистробин элюируют 20 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.3.1. Экстракция

Образец измельченного зерна пшеницы массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см дистиллированной воды, 40 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 40 куб. см ацетонитрила и помещая на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 минут при комнатной температуре.

Затем объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) объемом 250 куб. см, оставляют до полного разделения слоев в делительной воронке. Нижний водный слой отбрасывают, а верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2 "Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей" и п. 9.2.3 "Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак С16".

После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.4.1. Экстракция

Образец измельченной соломы пшеницы массой 5 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см ацетонитрила и оставляют при комнатной температуре на 10 минут. Пикоксистробин экстрагируют 75 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 9:1, помещая на 5 минут в ультразвуковую ванну. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 75 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 9:1 и помещая каждый раз на 5 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 минут при комнатной температуре.

Затем объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см (нерастворившуюся соль оставляют в колбе), оставляют до полного разделения слоев и нижний водный слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2 "Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей" и п. 9.2.3 "Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак С16".

После очистки элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.5.1. Экстракция

Образец измельченных корнеплодов сахарной свеклы массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, приливают туда 40 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 10 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 40 куб. см ацетонитрила и помещая на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 10 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 минут при комнатной температуре.

Затем объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) объемом 250 куб. см, оставляют до полного разделения слоев в делительной воронке. Нижний водный слой отбрасывают, а верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2 "Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей" и п. 9.1.2 "Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия".

После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.6.1. Экстракция

Образец измельченной зеленой массы сахарной свеклы массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, приливают туда 50 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 10 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия через фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и помещая на 5 минут в ультразвуковую ванну, а затем на 10 минут на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см с 5 г хлорида натрия, перемешивают и выдерживают 10 минут при комнатной температуре.

Затем объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку (нерастворившуюся соль оставляют в колбе) объемом 250 куб. см, оставляют до полного разделения слоев в делительной воронке. Нижний водный слой отбрасывают, а верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2 "Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей" и п. 9.2.3 "Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак С16".

При недостаточной степени очистки пробу очищают на концентрирующих патронах Диапак Амин.

9.6.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Амин

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, перемешивают и вносят на подготовленный патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см. Исходную колбу обмывают 10 куб. см смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:9 и вносят на патрон. Элюаты объединяют в концентраторе и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.7.1. Хроматограф жидкостный Agilent 1200 LCMS с диодно-матричным детектором G1315B с изменяемой длиной волны, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °С и стандартным автосамплером для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему (1200 Series Autosampler с дозирующим объемом от 0,1 до 100 куб. мм).

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Предколонка стальная Zorbax Eclipse XDB-С8, 12,5 мм х 2,1 мм, зернение 5 мкм, фирма "Agilent".

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 60:40.

Длина волны: 250 нм.

Время удерживания Пикоксистробина: 11,5 мин. +/- 3%.

Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

9.7.2. Хроматограф жидкостный Waters 515 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации N 15311-02, или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Предколонка стальная Simmetry С18, 20 мм х 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Температура колонки: 30 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 60:40.

Длина волны: 250 нм.

Время удерживания Пикоксистробина: 12,2 мин. +/- 3%.

Чувствительность не менее 0,005 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Agilent Technologies ChemStation for LC 3D или Empower2.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Пикоксистробина рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):