"МУК 4.2.3033-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 20.07.2012)

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D - продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма P. verruculosum PV2007 BKM F-3972D в атмосферном воздухе и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D является продуцентом ряда карбогидраз (комплекса целлюлаз, целлобиаз и сопутствующих ферментов - ксиланазы и ксилоглюканазы). Получен с помощью методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P. verruculosum 27K BKM F-3764D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под номером BKM F-3972D.

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, сусло-агар) при t 26 - 30 °C в течение 7 - 10 суток, pH 4,5 - 5,0. При t 5 °C рост колоний не наблюдается.

На среде Чапека с дрожжевым автолизатом колонии достигают 23 - 24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1,5 - 2,0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии - палево-оранжевая.

При микроскопировании штамм имеет конидиеносцы двухъярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2 - 3 мкм. Метулы расходящиеся размером 10 - 13 x 2,5 - 3,0 мкм, фиалиды ампуллиформные размером 7 - 8 x 2,8 - 3,0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3,0 - 3,5 мкм.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м³ воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".

6.2. ГОСТ 12.1.005-88 "Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами".

6.3. ГОСТ 12.1.019-79 "Электробезопасность при работе с электроустановками".

6.4. Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении (760 +/- 20) мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи одного из пробоотборников со скоростью 10 - 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента и вида пробоотборника.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

При выполнении анализа воздуха прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют глюкозу из расчета 15 - 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °C. Через 4 - 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки.

При выполнении анализа воздуха дополнительным методом пробы воздуха отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5%-й карбокси-метилцеллюлозы. Культивируют в термостате при t 28 °C в течение двух суток и проводят окрашивание 0,1%-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под действием комплекса целлюлаз.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с "Требованиями к ростовым свойствам питательных сред" (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м³ воздуха производят по формуле:

где X - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м³ воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента.

Эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см² оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно, за 1 мин - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см². Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м³ воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин x t (время аспирации, мин).

Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

1. РД 52.04.186-96 "Руководство по контролю загрязнения атмосферы". М., 1991, 693 с.

2. ГОСТ 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

3. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во стандартов, 1981, 3 с.