"МУК 4.1.3120-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пирипроксифена в цитрусовых (плоды, сок) методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 30.10.2013)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, М.В. Ларькина, О.Е. Егорченкова, С.К. Рогачева).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Протокол от 29 октября 2013 г. N 3).

3. Утверждены вр.и.о. руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 октября 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации N 01.00282-2008/0176.06.09.13 от 06.09.2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для измерения концентрации пирипроксифена в цитрусовых (плоды, сок) в диапазонах 0,025 - 0,25 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: пирипроксифен.

Химический класс: дифенил-производные.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-феноксифенил(RS)-2-(2-пиридилокси)пропиловый эфир.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 321,37.

Порошок от белого до желтого цвета со слабым характерным запахом. Температура плавления 47,4 °C. Давление паров менее (при 23 °C). Растворимость в воде 0,367 мг/дм3 (при 25 °C). Коэффициент распределения н-октан/вода (при 25 °C). Стабильность в водных растворах: при pH 4, 7, 9 период полураспада более 367 дней при 20 °C.

Растворимость в органических растворителях (г/100 см3): гексан - 7,67, метанол - 6,01 (при 20 °C).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность для крыс > 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность для крыс > 2000 мг/кг, острая ингаляционная токсичность для крыс > 1300 мг/м3 при экспозиции 4 ч.

Область применения. Пирипроксифен - инсектицид контактного и кишечного действия из группы аналогов ювенильного гормона, подавляющий эмбриогенез и процесс метаморфоза насекомых. Активно подавляет развитие мух, жуков, комаров и других насекомых.

При соблюдении всех регламентируемых условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерения при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении пирипроксифена с использованием капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с термоионным детектором (ТИД) и/или масс-селективным (МСД) детектором после извлечения вещества из анализируемых образцов ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать "Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением", ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

К выполнению измерений допускают специалистов, прошедших обучение, освоивших методику, владеющих техникой, имеющих опыт работы на газовом хроматографе и подтвердивших соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности по п. 13.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов и раствора внесения, установление градуировочной характеристики, приготовление смесей растворителей для экстракции и очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения пирипроксифена на ней.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.2.2. Очистка растворителей. Каждый растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2.1. Исходный раствор пирипроксифена для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,01 г пирипроксифена, растворяют в 50 - 60 см3 ацетона, доводят ацетоном до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение месяца.

7.2.2. Рабочий раствор N 1 пирипроксифена для внесения (концентрация 10,0 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10,0 см3 исходного градуировочного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см3 (п. 7.2.1), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор N 1 с концентрацией пирипроксифена 10,0 мкг/см3.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроля качества результатов измерений методом добавок.

7.2.3. Рабочие растворы N 2 - 5 пирипроксифена для градуировки (концентрация 0,5 - 5,0 мкг/см3). В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 см3 исходного раствора с концентрацией 100,0 мкг/см3 (п. 7.2.1), доводят до метки смесью: гексан-ацетон (2:8, по объему), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрациями пирипроксифена 0,5; 1,0; 2,5 и 5,0 мкг/см3.

Растворы хранят в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение месяца.

Градуировочную характеристику, выражающую линейную (с угловым коэффициентом) зависимость площади пика от концентрации пирипроксифена в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В испаритель хроматографа вводят по 1 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков пирипроксифена.

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,1 г марганцовокислого калия, растворяют в 50 - 70 см3 деионизованной воды, доводят водой до метки, тщательно перемешивают.

Смесь гексан-этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 80 см3 гексана и 20 см3 этилацетата, перемешивают.

Смесь гексан-ацетон (объемное соотношение 2:8). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 20 см3 гексана и 80 см3 ацетона, перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 20 см3 гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают смесью гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, порцией по 20 см3, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,5 см3 раствора N 1 пирипроксифена с концентрацией 10 мкг/см3, упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 5 см3 смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 30 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды смесью гексан-этилацетат (8:2, по объему) порциями по 5 см3, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 15 см3 смеси гексан-этилацетат в объемном соотношении 8:2, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 40 см3 смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 см3) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 см3 смеси гексан-ацетон (2:8, по объему), анализируют содержание пирипроксифена по п. 9.4.

Фракции, содержащие пирипроксифен, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения пирипроксифена следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными: ГОСТ 4427-82 "Апельсины. Технические условия"; ГОСТ 4428-82 "Мандарины. Технические условия"; ГОСТ 4492-82 "Лимоны. Технические условия"; ГОСТ 26313-84 "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб"; "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.1979).

Отобранные пробы цитрусовых (плоды, сок) хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике в темноте не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Пробы сока анализируют в день изготовления.

Перед анализом образцы плодов измельчают.

Образец измельченных плодов цитрусовых массой 20 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 см3, добавляют 100 см3 ацетона и помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин. Пробе дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через бумажный фильтр средней плотности. Растительный остаток повторно дважды экстрагируют 100 см3 ацетона, выдерживая на встряхивателе 30 мин. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера, осадок на фильтре промывают 20 см3 ацетона.

Объединенный отфильтрованный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до объема 50 - 80 см3, добавляют 200 см3 этилацетата и повторно упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C до водного остатка (3 - 5 см3), вносят 70 см3 ацетонитрила (насыщенного гексаном) и подвергают очистке по п. 9.2.

К образцу сока с мякотью массой 20 г, находящемуся в конической колбе (с пришлифованной пробкой) вместимостью 250 см3, добавляют 100 см3 ацетона, интенсивно встряхивают в течение 5 мин, помещают в холодильник (4 °C) на 1 ч. Экстракт фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр средней плотности под вакуумом, дважды промывая остаток на фильтре 20 см3 ацетона.

Объединенный отфильтрованный экстракт упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до объема 50 - 80 см3, добавляют 200 см3 этилацетата, перемешивают и повторно упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C до водного остатка (3 - 5 см3), вносят 70 см3 ацетонитрила (насыщенного гексаном) и подвергают очистке по п. 9.2.

Объединенный отфильтрованный экстракт, полученный по пп. 9.1.1 или 9.1.2, переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 100 см3 гексана (насыщенного ацетонитрилом), интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой отделяют, верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию промывки, используя 70 см3 гексана (насыщенного ацетонитрилом). Ацетонитрильный раствор переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 см3, упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C, вносят 100 см3 5%-го водного раствора хлористого натрия, выдерживают 1 мин на ультразвуковой бане.

Водную фазу помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 100 см3 дихлорметана, интенсивно встряхивают 5 мин. После полного разделения фаз нижний дихлорметановый слой переносят в колбу для упаривания вместимостью 150 см3, фильтруя через слой безводного сульфата натрия (толщиной около 1 см), помещенный на бумажном фильтре в химическую воронку.

Экстракцию пирипроксифена повторяют еще дважды порциями дихлорметана объемом 100 см3, встряхивая в течение 5 мин.

Для полного разделения фаз содержимое воронки должно отстояться 10 - 15 мин. Следы дихлорметана в водной фазе недопустимы, поскольку это снижает полноту извлечения вещества.

Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 35 °C до объема 20 см3, добавляют 10 см3 этилацетата, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

Остаток, полученный по п. 9.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 5 см3 смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), выдерживают на ультразвуковой бане 1 мин. Затем раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.6. Колбу обмывают дважды смесью гексан-этилацетат (8:2, по объему) порциями по 5 см3, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 15 см3 смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему), элюат отбрасывают.

Пирипроксифен элюируют с колонки 40 см3 смеси гексан-этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 см3, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 смеси гексан-ацетон (2:8, по объему) и анализируют по п. 9.4.

9.4.1. Газовый хроматограф, снабженный термоионным детектором с пределом детектирования по азоту в азобензоле .

Хроматографическая, капиллярная, кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 5% - фенил-, 95% - диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 180 °C, выдержка 1 мин, нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 270 °C, выдержка 10 мин, затем нагрев колонки до температуры 280 °C.

Газ 1 (азот): давление 125 кПа, скорость 29,169 см/с, поток 0,815 см3/мин.

Газ 2: деление потока 1:6,1; сброс 5,0 см3/мин, с 1 мин - 20,0 см3/мин.

Газ 3 (водород): 13,0 см3/мин.

Газ 4 (воздух): 200,0 см3/мин.

Хроматографируемый объем: 1 мм3.

Линейный диапазон детектирования: 0,5 - 5,0 нг.

9.4.2. Хроматограф газовый с масс-селективным детектором (метод подтверждения)

Хроматографическая, капиллярная, кварцевая колонка длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 5% - фенил, 95% - диметилполисилоксан (толщина пленки сорбента 0,25 мкм).

Температура испарителя: 270 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура - 200 °C, выдержка 2 мин, нагрев колонки со скоростью 5 градусов в минуту до температуры 240 °C, выдержка 4 мин, нагрев колонки со скоростью 10 градусов в минуту до температуры 260 °C, выдержка 8 мин.

Газ 1 (гелий): поток в колонке 1,2 см3/мин.

Давление - 130,5 кПа.

Средняя линейная скорость - 34,1 см/с.

Хроматографируемый объем: 1 мм3.

Режим сканирования - SCAN.

Линейный диапазон детектирования: 0,5 - 5,0 нг.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочный раствор пирипроксифена с концентрацией 5,0 мкг/см3, разбавляют смесью гексан-ацетон (2:8, по объему) не более чем в 50 раз.

Содержание пирипроксифена в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где X - содержание пирипроксифена в пробе, мг/кг;

A - концентрация пирипроксифена, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см3;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

m - масса анализируемого образца, г.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

, при вероятности P = 0,95,

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание пирипроксифена в пробе менее 0,025 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,025 мг/кг - предел обнаружения пирипроксифена в цитрусовых (плодах и соке).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание пирипроксифена в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,5 до 5,0 мкг/см3.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемых для контроля градуировочных растворов сохраняется соотношение:

где X - концентрация пирипроксифена в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;

C - известная концентрация градуировочного раствора пирипроксифена, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пирипроксифена, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

где , , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (1) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (1) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R)

где , - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.