"МУК 4.1.2903-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Биксафена в воде, почве, зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)

1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева; Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 08.12.2010 N 0066.03.12.10.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Биксафена в воде в диапазоне 0,005 - 0,050 мг/куб. дм и в почве в диапазоне 0,01 - 0,10 мг/кг, а также уровня остаточных количеств в зерне зерновых культур в диапазоне 0,01 - 0,10 мг/кг и в соломе зерновых культур в диапазоне 0,02 - 0,20 мг/кг.

Название действующего вещества по ИЮПАК: N-(3',4'-дихлоро-5-флуробифенил-2-ил)-3-(дифлурометил)-1-метил-1Н-пиразол-4-карбоксоамид.

Структурная формула: (не приводится).

Молекулярная масса: 414,21.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белый, без запаха.

Температура плавления: 146,6 °C.

Температура кипения: разлагается при 250 °C.

Растворимость в воде, мг/куб. дм (20 °C): 0,49.

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °C): этилацетат - 82; ацетон - более 250; дихлорметан - 102; метанол - 32; n-гептан - 0,056; диметилсульфоксид - более 250.

Биксафен не подвергается гидролизу при pH 4, 7, 9 в течение 5 дней при температуре 50 °C.

Область применения. Биксафен - специфичный фунгицид против септориоза и ржавчины с длительным защитным действием. Относится к классу карбоксамидов и обладает локо-системным действием, подавляет прорастание спор и развитие мицелия. На биохимическом уровне ингибирует энзим сукцинат дегидрогеназу митохондриального респираторного канала.

Проходит регистрационные испытания в качестве фунгицида против большинства болезней, вызываемых грибами классов Аскомицеты, Базидиомицеты и Дейтеромицеты, на яровых и озимых зерновых с нормой расхода 0,8 - 1,0 л/га.

МДУ Биксафена (в импортируемой продукции): зерно пшеницы и ржи - 0,05 мг/кг, зерно ячменя и овса - 0,50 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Биксафена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак С.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия, концентрирующих патронов Диапак С для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонках с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак С, установление градуировочной характеристики.

7.1.1. Очистка ацетона

Ацетон помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм.

Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцово-кислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, очищенную воду и муравьиную кислоту.

В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 550 куб. см ацетонитрила, 450 куб. см очищенной воды и 1 куб. см муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Биксафена 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг Биксафена в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Биксафена 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Биксафена 1,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Биксафена 0,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Биксафена 0,2 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики.

7.2.2.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией Биксафена 0,1 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики.

7.2.2.7. Стандартные растворы Биксафена с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для внесения в образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,4; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

7.2.3. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, очищенную воду и муравьиную кислоту.

В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 550 куб. см ацетонитрила, 450 куб. см очищенной воды и 1 куб. см муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Биксафена в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см ацетонитрила.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения Биксафена на колонке с окисью алюминия

В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Биксафена в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C. Исходную колбу обмывают еще двумя порциями ацетонитрила объемом по 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие Биксафен, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюата.

Изучение поведения Биксафена на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.

7.5.1. Подготовка концентрирующих патронов Диапак С для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак С устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, затем 10 куб. см гексана. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.5.2. Проварка хроматографического поведения Биксафена на концентрирующих патронах Диапак С

Из стандартного раствора Биксафена в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают сначала 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, затем двумя порциями по 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и вносят полученные растворы последовательно на патрон. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие Биксафен, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Биксафен на концентрирующих патронах Диапак С проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии концентрирующих патронов.

Хроматографическую колонку Zorbax Eclipce XDB-C18 с предколонкой Zorbax Eclipce XDB-C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 ч.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 17.4.3.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна", ГОСТ 27262-87 "Корма растительного происхождения. Методы отбора проб".

Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C; пробы почвы - в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C.

Отобранные пробы зерна и соломы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов.

Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

9.1.1. Экстракция

Пробу воды объемом 100 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют туда 10 г хлористого натрия, 1 куб. см 6 М соляной кислоты (до pH 1) и перемешивают до полного растворения соли. Биксафен экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, собирая его через слой безводного сульфата натрия. Экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм раствора вводят в хроматограф.

9.2.1. Экстракция и очистка полученного экстракта

Пробу почвы (или измельченного зерна) весом 20 г (5 г для соломы) помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют туда 10 куб. см дистиллированной воды и выдерживают 5 мин. при комнатной температуре. Биксафен экстрагируют 50 куб. см ацетонитрила в течение 5 мин. в ультразвуковой ванне и дополнительно 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют через фильтр "красная лента" в делительную воронку объемом 250 куб. см. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила и помещая каждый раз на 5 мин. в ультразвуковую ванну и дополнительно на 5 мин. на аппарате для встряхивания проб. Пробы центрифугируют в течение 5 мин. при скорости 4000 оборотов в минуту, супернатант фильтруют. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 куб. см.

К полученному экстракту добавляют 50 куб. см гексана и интенсивно встряхивают воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще одной порцией гексана объемом по 50 куб. см. Гексан отбрасывают, а ацетонитрил собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному в п. 9.2.1, прибавляют 5 куб. см ацетонитрила, обмывают стенки концентратора, добавляют 100 куб. см дистиллированной воды, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Туда же прибавляют 10 г сухого хлорида натрия и интенсивно перемешивают до полного растворения соли. Биксафен экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой хлористого метилена объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, собирая его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

9.2.3. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия

Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на заранее подготовленную колонку, элюат собирают в концентратор. Исходную колбу обмывают 10 куб. см ацетонитрила и вносят на колонку. Элюаты объединяют и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

9.2.4. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С

Сухой остаток, полученный в п. 9.2.4, растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см гексана, перемешивают и вносят на заранее подготовленный концентрирующий патрон Диапак С, элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:9, элюат отбрасывают. Биксафен элюируют 10 куб. см смеси ацетона с гексаном в соотношении 1:4, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см (почва, зерно) и в 1 куб. см (солома) смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм раствора вводят в хроматограф.

Хроматограф жидкостный Agilent 1200 LCMS с диодно-матричным детектором G1315B с изменяемой длиной волны, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C и стандартным автосамплером для автоматического ввода пробы в хроматографическую систему (1200 Series Autosampler с дозирующим объемом от 0,1 до 100 куб. мм).

Колонка стальная Zorbax Eclipce XDB-C18, 150 мм х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма "Agilent".

Предколонка стальная Zorbax Eclipce XDB-C8, 12,5 мм х 2,1 мм, зернение 5 мкм, фирма "Agilent".

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода - муравьиная кислота в соотношении 550:450:1.

Длина волны: 250 нм.

Время удерживания Биксафена: 8,405 +/- 3% мин.

Чувствительность не менее 10 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Agilent Technologies ChemStation for LC 3D.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Биксафена рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".