"МУК 4.1.3099-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пентиопирада в воде, почве, яблоках и яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 08.08.2013)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 8 августа 2013 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 24.04.2012 N 0117.24.04.12

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации пентиопирада в воде в диапазоне 0,005 - 0,05 мг/куб. дм и в почве в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, а также уровня его остаточных количеств в яблоках и яблочном соке в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Пентиопирад.

(RS)-N-[2-(1,3-диметилбутил)-3-тиенил]-1-метил-3-(трифторметил)-1H-пиразол-4-карбоксамид.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 359,4.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белый, без запаха.

Давление паров: (25 °C).

Коэффициент распределения октанол-вода:

(pH 4); (pH 7); (pH 10).

Температура плавления: 108,7 °C.

Растворимость в воде (мг/куб. дм, при 20°C): 7,53.

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °C): ацетон - 557; н-гексан - 0,75; гептан - 0,74; дихлорметан - 531; ксилол - 42,7; толуол - 67,0; метанол - 402; этанол - 234,5; этил-ацетат - 349.

Стабилен в водных растворах при pH 3 - 10 и температуре 20 °C в низких концентрациях (менее 1 мг/куб. дм).

Пентиопирад относится к мало опасным по острой оральной ( для крыс более 2000 мг/кг) и дермальной токсичности ( для крыс более 2000 мг/кг), но к умеренно опасным веществам по ингаляционной токсичности ( для крыс (4 ч) более 5669 мг/куб. м). Не раздражает кожу и слизистую оболочку глаз. Не является мутагеном.

Пентиопирад - системный фунгицид, ингибирует процесс дыхания грибов путем связывания с митохондриальным дыхательным комплексом II, останавливает прорастание спор, ингибирует рост мицелия и обладает сильным антиспоруляционным действием.

Пентиопирад используется для борьбы с паршой и мучнистой росой на яблонях с нормой расхода 0,375 - 1,125 л/га.

В России гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2

Метод основан на определении пентиопирада с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем и очистки экстракта на концентрирующих патронах N 1 и 2.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Примечание. Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-90 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов N 1 и 2 для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на концентрирующих патронах N 1 и 2, установление градуировочной характеристики.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/куб. дм. Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

7.1.4. Очистка хлористого метилена

Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.

7.2.1. Приготовление рабочих растворов

7.2.1.1. Приготовление 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты. В мерную колбу объемом 1000 куб. см помещают 500 куб. см очищенной воды, прибавляют 1,0 куб. см муравьиной кислоты, перемешивают и доводят водой объем в колбе до метки.

7.2.1.2. Приготовление 0,1 н раствора соляной кислоты. Пипеткой отбирают 8,2 куб. см концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, куда предварительно наливают около 500 куб. см очищенной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил и 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты.

В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 600 куб. см ацетонитрила и 350 куб. см 0,1%-го водного раствора муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.3. Приготовление градуировочных растворов

7.2.3.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией пентиопирада 1,0 мг/куб. см. Взвешивают 50 мг пентиопирада в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.3.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией пентиопирада 10,0 мкг/куб. см. Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помешают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией пентиопирада 1,0 мкг/куб. см. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией пентиопирада 0,5 мкг/куб. см. Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией пентиопирада 0,2 мкг/куб. см. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.6. Стандартный раствор N 6 с концентрацией пентиопирада 0,1 мкг/куб. см. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помешают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.7. Стандартные растворы пентиопирада с концентрацией 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для внесения в образцы. Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора N 2 готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см пентиопирада, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации пентиопирада в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по четырем растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.5. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка концентрирующего патрона N 2 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1 - 2 кап./с).

Патрон N 2 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см ацетона, 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения пентиопирада на концентрирующем патроне N 2

Из стандартного раствора пентиопирада в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают последовательно двумя порциями по 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие пентиопирад, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения пентиопирада на концентрирующих патронах N 2 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.5.1. Подготовка концентрирующего патрона N 1 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1 - 2 кап./с).

Патрон N 1 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 2:1 и 10 куб. см воды. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения пентиопирада на концентрирующем патроне N 1

Из стандартного раствора пентиопирада в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см воды, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4, 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2 и двумя порциями по 10 куб. см смеси ацетонитрила с 0,1%-м водным раствором муравьиной кислоты в соотношении 60:35. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие пентиопирад, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения пентиопирада на концентрирующих патронах N 1 проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

Хроматографическую колонку с предколонкой устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 ч.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 17.4.3.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ 27572-87 "Яблоки свежие для промышленной переработки. Технические условия", ГОСТ 656-79 "Соки плодовые и ягодные натуральные".

Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более 10 суток.

Для длительного хранения проб почвы почву подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Пробы яблок хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре от 0 до 4°C не более суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °C до 2 лет. Перед анализом яблоки размораживают и измельчают на терке.

Пробы яблочного сока хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C не более 5 суток.

9.1.1. Экстракция

Пробу воды объемом 100 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют туда 10 г хлористого натрия. Пентиопирад экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, собирая его через слой безводного сульфата натрия. Экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.2.1. Экстракция

Пробу почвы весом 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют 10 куб. см дистиллированной воды, 50 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 4 мин. на скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют через фильтр средней плотности в коническую колбу объемом 250 куб. см с 10 г сухого хлористого натрия. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила и помещая каждый раз на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Пробы центрифугируют, экстракты фильтруют и объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см с 10 г сухого хлористого натрия, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 мин.

Объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см (не растворившуюся соль оставляют в колбе), оставляют до полного разделения слоев и нижний (водный) слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

Далее проводят очистку экстракта на концентрирующих патронах N 1 и 2.

9.2.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 2

Сухой остаток, полученный по п. 9.2.1, растворяют в 2 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют туда 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на заранее подготовленный патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и вносят на патрон, элюат объединяют с предыдущим. Объединенный элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 1

Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 9 куб. см воды, перемешивают и вносят на патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:4 и 10 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:2 и последовательно вносят на патрон, элюаты отбрасывают.

Пентиопирад элюируют 10 куб. см смеси ацетонитрила с 0,1%-м водным раствором муравьиной кислоты в соотношении 60:35. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.3.1. Экстракция

Образец измельченных яблок массой 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют туда 10 куб. см 0,1 н соляной кислоты, 50 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Ацетонитрильный экстракт фильтруют в коническую колбу объемом 250 куб. см с 10 г сухого хлористого натрия. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила и помещая каждый раз на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракты фильтруют и объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см с 10 г сухого хлористого натрия, перемешивают и выдерживают при комнатной температуре 10 мин.

Объединенный экстракт из колбы переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см (нерастворившуюся соль оставляют в колбе), оставляют до полного разделения слоев и нижний (водный) слой отбрасывают. Верхний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 2 и по п. 9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 1.

После очистки элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.4.1. Экстракция

Образец яблочного сока массой 20 г помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют туда 10 мл 0,1 н соляной кислоты, 20 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, 30 куб. см ацетонитрила и интенсивно встряхивают воронку 2 мин. После полного разделения фаз нижний (водный) слой переносят в плоскодонную колбу объемом 100 куб. см, а верхний ацетонитрильный экстракт собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия. Водный слой возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию еще два раза, используя каждый раз по 30 куб. см ацетонитрила и встряхивая делительную воронку по 2 мин. Ацетонитрильные экстракты собирают в концентратор объемом 250 куб. см, пропуская их через слой безводного сульфата натрия. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 2 и по п. 9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах N 1.

После очистки элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Хроматографическая система, включающая:

- хроматограф жидкостный, снабженный термостатом для колонок с диапазоном температур от 15 до 80 °C, с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу;

- компьютерное программное обеспечение, контролирующее работу всего прибора, обеспечивающее сбор и хранение всех хроматограмм в процессе проведения хроматографического анализа, обеспечивающее обработку результатов измерений, вывод и расчет хроматограмм и количественный анализ.

Колонка хроматографическая стальная, длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C18.

Предколонка хроматографическая стальная, длиной 20,0 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернением 5 мкм, заполненная сорбентом с привитыми полярными группами C8.

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1%-й водный раствор муравьиной кислоты в соотношении 650:350.

Длина волны: 240 нм.

Время удерживания пентиопирада: 10,014 мин. +/- 3%.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Содержание пентиопирада рассчитывают по формуле:

где X - содержание пентиопирада в пробе, мг/кг или мг/куб. дм;

- высота (площадь) пика стандарта, мм;

- высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г (куб. см);

P - содержание пентиопирада в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг (или мг/куб. дм)" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг (или мг/куб. дм) - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений, а также контроль стабильности градуировочной характеристики осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

Контроль стабильности градуировочной характеристики для пентиопирада проводят при смене основного градуировочного раствора N 1 каждые 6 месяцев, при смене основных градуировочных растворов N 2, 3, 4, 5 и 6 - каждый месяц, а также в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание пентиопирада в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/куб. см.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация пентиопирада контрольного измерения, мкг/куб. см;

С - известная концентрация градуировочного раствора пентиопирада в смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/куб. см;

3,22 - погрешность градуировочной характеристики, %.

Если величина расхождения (A) превышает 3,22%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов пентиопирада, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики определяют ее заново согласно п. 7.3.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

где , , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

где , - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.