"МУК 4.1.2904-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Ципросульфамида в воде, почве, зеленой массе, зерне и масле кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 12.07.2011)

1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева; Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 12 июля 2011 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 25.04.2011 N 0086.25.04.11.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Ципросульфамида в воде в диапазоне 0,005 - 0,050 мг/куб. дм и в почве в диапазоне 0,01 - 0,10 мг/кг, а также уровня его остаточных количеств в зеленой массе кукурузы в диапазоне 0,02 - 0,20 мг/кг, в зерне и масле кукурузы в диапазоне 0,01 - 0,10 мг/кг.

Название действующего вещества по ИЮПАК: N-{[(4-циклопропилкарбамоил)фенил]сульфонил}-2-метоксибензамид.

Структурная формула (не приводится).

Температура плавления: выше 450 °C.

Растворимость в воде (мг/куб. дм, при 20 °C): при pH 4 - 0,0034; pH 5,1 - 0,0125; pH 6,9 - 1,09; pH 8,1 - 26,1.

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, при 20 °C): ацетон - 3,1; н-гексан < 0,001; диметилсульфоксид > 200; дихлорметан - 3,5; толуол - 0,0047; этанол - 0,47; этилацетат - 0,51.

Стабилен в водных растворах при pH 3 - 10 и температуре 22 °C до 20 месяцев.

Область применения препарата. Ципросульфамид - антидот, обеспечивающий достаточно высокий уровень толерантности культуры к гербицидному препарату.

В России гигиенические нормативы не установлены.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Ципросульфамида с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами, на колонках с окисью алюминия и концентрирующих патронах Диапак С, Диапак Диол и Диапак Амин.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или специальное химическое образование, опыт работы в химической лаборатории, прошедшие обучение и владеющие техникой проведения анализа, освоившие метод анализа в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы контроля при проведении процедуры контроля погрешности анализа.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, относительной влажности не более 80% и нормальном атмосферном давлении;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка колонок с окисью алюминия, концентрирующих патронов Диапак С, Диапак Диол и Диапак Амин для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на колонке с окисью алюминия и на концентрирующих патронах Диапак С, Диапак Диол и Диапак Амин, установление градуировочной характеристики.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

7.1.2. Очистка ацетона

Ацетон, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 ч. Затем ацетон сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей, прибавляют туда марганцовокислый калий из расчета 100 мг/куб. дм. Ацетон перегоняют при температуре 56,2 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 56,2 °C, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллированную воду помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к ней марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 ч.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C отбрасывают.

7.1.4. Очистка хлористого метилена

Хлористый метилен промывают равным объемом 5%-го раствора натрия углекислого (безводного), осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 12 - 24 ч. Затем хлористый метилен сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей. Хлористый метилен перегоняют при температуре 40,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 40,0 °C, отбрасывают.

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду, а также муравьиную кислоту.

В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 450 куб. см ацетонитрила, 550 куб. см очищенной воды и 1,0 куб. см муравьиной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2. Приготовление рабочих растворов

7.2.2.1. Приготовление 6 М раствора соляной кислоты.

Мерным цилиндром отбирают 246 куб. см концентрированной соляной кислоты и осторожно переносят в мерную колбу на 500 куб. см, куда предварительно наливают около 100 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2.2. Приготовление 1 М раствора гидроокиси натрия.

Переносят в мерную колбу на 500 куб. см 20 г гидроокиси натрия, добавляют 200 - 300 куб. см дистиллированной воды. Затем раствор перемешивают и после охлаждения доводят водой объем в колбе до метки (при приготовлении раствора соблюдать осторожность и работать под тягой).

7.2.2.3. Приготовление 0,05 М раствора двузамещенного фосфорнокислого калия.

7.2.3. Приготовление градуировочных растворов

7.2.3.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Ципросульфамида 1,0 мг/куб. см.

Взвешивают 50 мг Ципросульфамида в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 1 хранится в холодильнике в течение 6 месяцев.

7.2.3.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Ципросульфамида 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом. Стандартный раствор N 2 используется для приготовления стандартных растворов для установления градуировочной характеристики. Стандартный раствор N 2 хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Ципросульфамида 1,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 3 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Ципросульфамида 0,5 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 3 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 4 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Ципросульфамида 0,2 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 5 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.6. Стандартный раствор с концентрацией Ципросульфамида 0,1 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки смесью ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 при перемешивании. Стандартный раствор N 6 используется для установления градуировочной характеристики и хранится в холодильнике не более 30 суток.

7.2.3.7. Стандартные растворы Ципросульфамида с концентрацией 5,0; 2,0; 1,0; 0,4; и 0,2 мкг/куб. см для внесения в образцы.

Методом последовательного разведения ацетонитрилом стандартного раствора N 2 готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0; 0,4; и 0,2 мкг/куб. см и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы.

Методом последовательного разведения ацетоном стандартного раствора N 2 готовят растворы, содержащие по 2,0; 1,0; 0,4 и 0,2 мкг/куб. см и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы зерна и масла.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Ципросульфамида в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.6. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка колонки с окисью алюминия для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 3 г окиси алюминия с зернением 40/250 меш. и, аккуратно постукивая по стенкам колонки, формируют слой адсорбента. Непосредственно перед использованием колонку промывают 10 куб. см ацетонитрила.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения Ципросульфамида на колонке с окисью алюминия

В концентратор объемом 100 куб. см вносят 1 куб. см стандартного раствора Ципросульфамида в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мкг/куб. см и упаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора и наносят на подготовленную колонку. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C, растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют. Исходную колбу обмывают тремя порциями смеси ацетонитрил - ледяная уксусная кислота в соотношении 99:1 объемом 10 куб. см каждая и последовательно вносят их на колонку. Каждую порцию собирают отдельно в концентратор и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Определяют фракции, содержащие Ципросульфамид, полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Ципросульфамида на колонке проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии окиси алюминия.

7.5.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1-2 кап./с).

Патрон Диапак С устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см ацетона, 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения Ципросульфамида на концентрирующем патроне Диапак С

Из стандартного раствора Ципросульфамида в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1 и 10 куб. см смеси гексана и ацетона с ледяной уксусной кислотой в соотношении 50:50:0,1. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие Ципросульфамид, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Ципросульфамида на концентрирующих патронах Диапак С проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.6.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак Диол для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1-2 кап./с).

Патрон Диапак Диол устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:3 и 5 куб. см гексана. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.6.2. Проверка хроматографического поведения Ципросульфамида на концентрирующем патроне Диапак Диол

Из стандартного раствора Ципросульфамида в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 5 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1 и тремя порциями по 10, 5 и 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие Ципросульфамид, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Ципросульфамида на концентрирующих патронах Диапак Диол проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

7.7.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак Амин для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. (1-2 кап./с).

Патрон Диапак Амин устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см ацетона, 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1. Элюаты отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.7.2. Проверка хроматографического поведения Ципросульфамида на концентрирующем патроне Диапак Амин

Из стандартного раствора Ципросульфамида в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в концентратор объемом 100 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см гексана с ацетоном в соотношении 2:1, 10 куб. см гексана с ацетоном в соотношении 1:1, 10 куб. см ацетона, 10 куб. см смеси гексана и ацетона с ледяной уксусной кислотой в соотношении 50:50:0,1, 10 куб. см смеси гексана и ацетона с ледяной уксусной кислотой в соотношении 50:50:1. Элюат после прохождения каждой порции элюентов собирают в отдельные концентраторы объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и хроматографируют.

Определяют фракции, содержащие Ципросульфамид, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Изучение поведения Ципросульфамида на концентрирующих патронах Диапак Амин проводят каждый раз при отработке методики или поступлении новой партии патронов.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C8 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. в течение 3 - 4 ч.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 17.4.3.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ 13586.3-83 "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 8808-2000 "Масло кукурузное, ТУ" и ГОСТ Р 52062-2003 "Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы воды хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 4 °C; пробы почвы - в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °C.

Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

Зеленую массу кукурузы хранят в морозильной камере при температуре -18 °C.

Отобранные пробы зерна кукурузы подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов. Перед анализом пробы зерна кукурузы измельчают на лабораторной мельнице.

Пробы кукурузного масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °C.

Анализ образцов должен быть выполнен в течение одного дня.

9.1.1. Экстракция

Пробу воды объемом 100 куб. см помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют туда 10 г хлористого натрия, 1 куб. см 6 М соляной кислоты до pH 1 и перемешивают до полного растворения соли. Ципросульфамид экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 30 куб. см, встряхивая каждый раз делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, собирая его через слой безводного сульфата натрия. Экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.2.1. Экстракция и очистка полученного экстракта

Пробу почвы весом 20 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют туда 50 куб. см ацетонитрила и помещают на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин. на скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют через фильтр "красная лента" в делительную воронку объемом 250 куб. см. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила и помещая каждый раз на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Пробы центрифугируют, экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке объемом 250 куб. см.

Объединенный ацетонитрильный экстракт в делительной воронке промывают двумя порциями гексана объемом по 50 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний гексановый слой отбрасывают, а ацетонитрильный экстракт собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

9.2.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

К сухому остатку в концентраторе, полученному по п. 9.2.1, прибавляют 5 куб. см ацетона, 50 куб. см щелочного буфера pH 9, перемешивают и переносят в делительную воронку объемом 250 куб. см. Полученную смесь промывают двумя порциями по 30 куб. см хлористого метилена, интенсивно встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз нижний слой (хлористый метилен) отбрасывают. Водную фракцию в делительной воронке подкисляют 6 М соляной кислотой до pH 2. Ципросульфамид экстрагируют тремя порциями хлористого метилена объемом по 20 куб. см, каждый раз интенсивно встряхивая воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний слой (хлористый метилен) объединяют в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

9.2.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С

Сухой остаток, полученный по п. 9.2.2, растворяют в 2 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на заранее подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 4:1, элюат отбрасывают. Ципросульфамид элюируют 10 куб. см смеси гексана и ацетона с ледяной уксусной кислотой в соотношении 50:50:0,1. Элюат собирают в концентратор объемом по 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.3.1. Экстракция и очистка полученного экстракта

Образец измельченного зерна кукурузы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу объемом 250 куб. см, прибавляют 50 куб. см ацетонитрила, помещают в микроволновую печь и нагревают 1 мин. при мощности 350 ватт. Ацетонитрильный экстракт декантируют в полипропиленовую банку для центрифугирования объемом 200 куб. см. Экстракцию повторяют еще 2 раза в тех же условиях и с тем же количеством растворителя. Экстракты объединяют и центрифугируют в течение 5 минут при скорости 4000 оборотов в минуту. Экстракт фильтруют в делительную воронку объемом 250 куб. см.

К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 куб. см гексана и встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний слой (ацетонитрил) возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру еще раз, используя 50 куб. см гексана. Нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

9.3.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Сухой остаток, полученный по п. 9.3.1, растворяют в 5 куб. см ацетона и проводят очистку по п. 9.2.2 "Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей".

9.3.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С

Сухой остаток, полученный по п. 9.3.2, растворяют в 2 куб. см ацетона и проводят очистку на концентрирующих патронах Диапак С по п. 9.2.3 "Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С".

9.3.4. Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия

Сухой остаток в концентраторе, полученный по п. 9.3.2, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывают стенки концентратора, наносят на заранее подготовленную колонку, элюат отбрасывают. Исходную колбу обмывают тремя порциями по 10 куб. см смеси ацетонитрила с ледяной уксусной кислотой в соотношении 99:1 и вносят на колонку. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.4.1. Экстракция и очистка полученного экстракта

Образец измельченной зеленой массы кукурузы массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции объемом 250 куб. см, прибавляют 50 куб. см ацетонитрила, помещают на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Ацетонитрильный экстракт фильтруют через фильтр "красная лента" в делительную воронку объемом 250 куб. см. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 50 куб. см ацетонитрила и помещая на 5 мин. в ультразвуковую ванну, а затем на 5 мин. на аппарат для встряхивания проб. Экстракты объединяют в делительной воронке объемом 250 куб. см.

К ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 куб. см гексана и встряхивают делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке верхний слой (гексан) отбрасывают, а нижний слой (ацетонитрил) возвращают в делительную воронку и повторяют процедуру еще раз, используя 50 куб. см гексана. Нижний ацетонитрильный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

9.4.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Сухой остаток, полученный по п. 9.4.1, растворяют в 5 куб. см ацетона и проводят очистку по п. 9.2.2 "Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей".

9.4.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С

Сухой остаток, полученный по п. 9.4.2, растворяют в 2 куб. см ацетона и проводят очистку на концентрирующих патронах Диапак С по п. 9.2.3 "Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С".

9.4.4. Очистка экстракта на колонках с окисью алюминия

Сухой остаток, полученный по п. 9.4.3, растворяют в 10 куб. см ацетонитрила и проводят очистку на колонках с окисью алюминия по п. 9.3.4 "Очистка экстракта на колонках с окисью алюминия".

9.4.5. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Диол

Сухой остаток, полученный по п. 9.4.4, растворяют в 1 куб. ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 5 куб. см гексана, перемешивают и вносят на заранее подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 9:1, элюат отбрасывают. Ципросульфамид элюируют 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

9.4.6. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Амин

Сухой остаток, полученный по п. 9.4.5, растворяют в 2 куб. см ацетона, тщательно обмывая стенки концентратора, прибавляют 8 куб. см гексана, перемешивают и вносят на заранее подготовленный патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают последовательно 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1, 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 1:1, 10 куб. см ацетона, 10 куб. см смеси гексана и ацетона с ледяной уксусной кислотой в соотношении 50:50:0,1, все элюаты отбрасывают. Ципросульфамид элюируют 10 куб. см смеси гексана и ацетона с ледяной уксусной кислотой в соотношении 50:50:1. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

9.5.1. Экстракция

Из пробы кукурузного масла отбирают в стакан навеску массой 20 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 куб. см тремя порциями гексана объемом по 30 куб. см. Ципросульфамид экстрагируют тремя порциями ацетонитрила объемом по 50 куб. см, встряхивая делительную воронку 2 мин. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают через слой безводного сульфата натрия в концентратор объемом 250 куб. см. Верхний слой (гексан) отбрасывают.

Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.2 "Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей", по п. 9.2.3 "Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак С", по п. 9.3.4 "Очистка экстракта на колонке с окисью алюминия" и по п. 9.4.5 "Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Диол".

После очистки элюат упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси ацетонитрила с водой в соотношении 1:1 и 20 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Хроматограф жидкостной Waters 515 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу, номер госрегистрации N 15311-02 или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм х 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Предколонка стальная Symmetry C8, 20 мм х 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода - муравьиная кислота в соотношении 450:550:1.

Длина волны: 250 нм.

Время удерживания Ципросульфамида: 7,143 мин. +/- 2%.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Чувствительность не менее 0,005 AUFS (единиц абсорбции на шкалу).

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Millenium 3.05.01.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Ципросульфамида рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Российский государственный аграрный университет - МСХА им. К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".