"МУК 4.1.3074-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флудиоксонила в репке лука, чесноке и зеленой массе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 19.07.2013)

1. Разработаны ФБУН "Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана" Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова, В.М. Волков).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации от 24.08.2012 N 0129.24.08.12.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовых концентраций флудиоксонила в репке лука, чесноке и зеленой массе в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: флудиоксонил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-(2,2-дифтор-1,3-бензодиоксол-4-ил)пиррол-3-карбонитрил.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: .

Молекулярная масса: 248,2.

Кристаллическое вещество желтоватого цвета без запаха. Температура плавления: 199,8 °C. Давление паров при 25 °C: . Растворимость в органических растворителях (г/дм3, при 25 °C): ацетон - 190; этанол - 44, толуол - 2,7; н-октанол - 20; гексан - 0,0078. Растворимость в воде: 1,8 мг/дм3 (25 °C). Коэффициент распределения н-октанол/вода: (25 °C). Гидролитически стабилен до 70 °C в диапазоне pH 5 - 9.

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность для крыс и мышей > 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность для крыс > 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность для крыс > 2,6 мг/м3 (4 ч).

Область применения препарата

Флудиоксонил - контактный фунгицид широкого спектра действия с продолжительной активностью.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении флудиоксонила с использованием обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым и/или флуоресцентным детекторами после извлечения вещества из анализируемых образцов смесью ацетонитрил - вода (8:2, по объему), очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленные ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004-90.

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление градуировочных растворов, раствора внесения, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, приготовление смеси растворителей для очистки экстрактов на колонке, подготовка колонки с силикагелем, проверка хроматографического поведения флудиоксонила на ней.

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.4.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.4.2. Очистка растворителей. Каждый растворитель промывают последовательно 5%-ным водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 500 см3 ацетонитрила, вносят 500 см3 бидистиллированной воды, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 0,8 см3/мин до установления стабильной базовой линии.

7.4.1. Исходный раствор флудиоксонила для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,010 г флудиоксонила, растворяют в 50 - 70 см3 ацетонитрила, доводят до метки этим же растворителем, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике при температуре 4 - 6 °C в течение 3 месяцев.

Градуировочные растворы N 2 - 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.4.2. Раствор N 1 флудиоксонила для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10,0 см3 исходного раствора флудиоксонила с концентрацией 100 мкг/см3 (п. 7.4.1), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике при 4 - 6 °C в течение 3 месяцев.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом "внесено-найдено" и контроле точности методом "добавок".

7.4.3. Рабочие растворы N 2 - 5 флудиоксонила для градуировки (концентрация 0,05 - 0,5 мкг/см3).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают по 0,5; 1,0; 2,5 и 5 см3 раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/см3 (п. 7.4.2), доводят до метки подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы N 2 - 5 с концентрацией флудиоксонила 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мкг/см3 соответственно.

Растворы хранятся в холодильнике при 4 - 6 °C в течение месяца.

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площадей пиков от концентрации флудиоксонила в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки N 2 - 5.

В инжектор хроматографа вводят 50 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

Смесь гексан - этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 80 см3 гексана и 20 см3 этилацетата, перемешивают.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 - 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 30 см3 гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 см3 смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 8:2, скорость прохождения растворителя 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

В круглодонную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора N 1 флудиоксонила с концентрацией 10 мкг/см3, упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C. Сухой остаток растворяют в 3 см3 смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему), помещая на ультразвуковую баню на 40 - 60 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают дважды этой же смесью растворителей порциями по 3 см3, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 40 см3 смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 8:2, элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 60 см3 смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 см3) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 см3 подвижной фазы для ВЭЖХ, анализируют содержание флудиоксонила по п. 9.4.

Фракции, содержащие флудиоксонил, объединяют и вновь анализируют.

Примечание. Проверку хроматографического поведения флудиоксонила следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными: ГОСТ 1723-86 "Лук репчатый свежий заготовляемый и поставляемый. Технические условия", ГОСТ Р 51783-01 "Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. Технические условия", ГОСТ 7977-87 "Чеснок свежий заготовляемый и поставляемый. Технические условия", ГОСТ 27569-87 "Чеснок свежий реализуемый. Технические условия", "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (от 21.08.79 N 2051-79).

Отобранные пробы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы измельчают.

Измельченный образец массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 - 300 см3, вносят 100 см3 смеси ацетонитрил - вода (8:2, по объему) и помещают на встряхиватель на 1 ч.

Пробе дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разрежения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр средней плотности. Осадок на фильтре промывают 30 см3 смеси ацетонитрил - вода (8:2, по объему). Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/2 его часть (эквивалентную 10 г образца) переносят в делительную воронку на 100 - 250 см3 и очищают в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2, затем на колонке с силикагелем по п. 9.3.

К аликвоте экстракта пробы (1/2 часть), находящейся в делительной воронке, добавляют 20 см3 гексана, интенсивно встряхивают 1 мин. Верхний гексановый слой отбрасывают. Нижнюю ацетонитрильную фазу переносят в колбу для упаривания на 250 см3 и упаривают до водного остатка (5 - 10 см3) при температуре 35 - 40 °C.

Водный остаток в колбе переносят в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 70 см3 дистиллированной воды, 20 см3 насыщенного хлористого натрия и 20 см3 смеси гексан - трет-бутилметиловый эфир (4:1, по объему), предварительно обмыв ими колбу, в которой находилась проба, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, после полного разделения фаз верхний слой собирают, нижний водный слой возвращают в воронку и экстракцию повторяют новой порцией смеси гексан - метил-третбутиловый эфир объемом 20 см3. Нижний водный слой отбрасывают.

Объединенный экстракт фильтруют через слой (около 2 см) безводного сульфата натрия, помещенного на бумажном фильтре в химическую воронку, в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 150 см3, упаривают досуха. Остаток растворяют в 3 см3 смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) и очищают на колонке с силикагелем по п. 9.3.

Растворенный в 3 см3 смеси гексан - этилацетат (8:2, по объему) остаток наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают смесью гексан - этилацетат дважды (8:2, по объему), порциями по 3 см3, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку - 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 40 см3 смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 8:2, элюат отбрасывают.

Флудиоксонил элюируют с колонки 50 см3 смеси гексан - этилацетат в объемном соотношении 8:2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 см3, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °C, остаток растворяют в 2 см3 подвижной фазы и анализируют содержание флудиоксонила по п. 9.4.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым и/или флуоресцентным детекторами с переменной длиной волны, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки.

Хроматографическая колонка стальная длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 5 мкм.

Температура колонки: 25 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода (50:50, по объему).

Скорость потока элюента: 0,8 см3/мин.

Объем вводимой пробы: 50 мм3.

Линейный диапазон детектирования: 2,5 - 25 нг.

1. Ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны

Рабочая длина волн: 268 нм.

2. Флуоресцентный детектор с переменной длиной волны

Пробу вводят в инжектор хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площадь пика вещества, находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию флудиоксонила в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 0,5 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой, приготовленной по п. 7.2, не более чем в 50 раз.

Примечание. Идентификация с применением 2 альтернативных детекторов повышает надежность определения.

Содержание флудиоксонила в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

где C - концентрация флудиоксонила, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/см3;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

m - масса анализируемого образца, г;

K - коэффициент, учитывающий объем аликвоты экстракта, используемый для анализа (равен 2).

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

где , - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где - среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание флудиоксонила в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание флудиоксонила в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,05 до 0,5 кг/см3.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

где X - концентрация флудиоксонила в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;

C - известная концентрация градуировочного раствора флудиоксонила, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;

B - норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флудиоксонила, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.5.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом "добавок".

Величина добавки должна удовлетворять условию:

где - характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

где - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

где - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры рассчитывают по формуле:

где , , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

где , - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если выполняется условие (3), то воспроизводимость измерений считается удовлетворительной.

При превышении норматива контроля воспроизводимости эксперимент повторяют, при повторном превышении указанного норматива выясняют причины и по возможности их устраняют.