"МУК 4.1.2271-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Фамоксадона в виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.09.2007)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 21.06.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 сентября 2007 г.

4. Введены в действие с 15 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Фамоксадона в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг в виноградном соке.

Название действующего вещества по ИСО: Фамоксадон.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 3-анилино-5-метил-5-(4-феноксифенил)-2,4-оксазолидиндион.

Структурная формула (не приводится).

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм при 20 °С): ацетон - 274, ацетонитрил - 125, гексан - 0,0476, дихлорметан - 239, метанол - 10, толуол - 13,3, этилацетат - 124, н-октанол - 1,78.

Фамоксадон нестабилен в водных растворах. Гидролиз наблюдается в диапазоне pH 5 - 9, и время полураспада составляет 41 день, 2 дня и 93 минуты при pH 5,0; 7,0 и 9,0 соответственно.

В России для Фамоксадона установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД 0,01 мг/кг массы тела человека; МДУ в картофеле - 0,05 мг/кг.

Область применения. Фамоксадон - фунгицид контактного действия из группы оксазолидиндионов. Является ингибитором митохондриального дыхания, высокоэффективен против широкого спектра патогенных грибов с рекомендуемой нормой расхода 50 - 200 г д.в./га.

В России используется в виде смесевых препаратов для борьбы против фитофтороза и альтернариоза на картофеле с нормой расхода 150 г д.в./га, также разрешено применение в личных подсобных хозяйствах против фитофтороза и альтернариоза на картофеле с нормой расхода 15 г/10 л воды. Проходит регистрационные испытания на томатах, винограде и подсолнечнике.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Методика основана на определении Фамоксадона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, очистке перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах Диапак С16 и Диапак Амин.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Весы аналитические "OHAUS", СИГМА 11140.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г "ACCULAB" V600.

Колбы мерные на 25, 50 и 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50 - 100 куб. мм.

Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Хроматограф жидкостной Уотерс 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу или другой аналогичного типа, номер госрегистрации 15311-02.

Цилиндры мерные на 10, 25, 50, 100, 500 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Фамоксадон, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 97,7% (фирма Дюпон де Немур Интернэшнл, С.А).

Ацетон, осч., ТУ 2633-00-4-11291058-94.

Ацетонитрил осч., УФ-205 нм, ТУ 6-09-2167-84.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 7602-72.

Гексан, х.ч. для спектроскопии, ТУ 6-09-06-657-84.

Калий марганцовокислый, ч.д.а., ГОСТ 20490-75.

Кальций хлористый, х.ч., ГОСТ 4161-76.

Кислота ортофосфорная, 85%, Fluka, каталожный номер 79621.

Натрий сернокислый, безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Патроны концентрирующие Диапак С16 (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94.

Патроны концентрирующие Диапак Амин (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94.

Эфир диэтиловый, ГОСТ 6265-74.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аллонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Диапак С16 и Диапак Амин.

Аппарат для встряхивания проб "SKLO UNION TYP LT1".

Банки с крышками для экстракции на 250 мл, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Ванна ультразвуковая "UNITRA" UNIMA OLSZTYN UM-4.

Воронки химические для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi или ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, с водяной баней.

Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 куб. см, КПШ-100, КПШ-250, ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.

Колбы конические плоскодонные объемом 250, 500 и 1000 куб. см, ГОСТ 9737-70.

Концентраторы грушевидные и круглодонные объемом 100 и 250 куб. см, ГОСТ 10394-75.

Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Предколонка хроматографическая стальная, Symmetry С18 длиной 20 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.

Стаканы стеклянные объемом 100 - 500 куб. см, ГОСТ 25366-80Е.

Установка для перегонки растворителей.

Фильтры бумажные, "красная лента", ТУ-6-09-1678-86.

Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма Уотерс.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак С16 и Диапак Амин для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, построение калибровочной кривой.

7.1.1. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия. (А. Гордон, Р. Форд Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 438 - 439).

7.1.2. Очистка гексана

Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А. Гордон, Р. Форд Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 441).

7.1.3. Очистка диэтилового эфира

Диэтиловый эфир сушат над хлористым кальцием и перегоняют.

7.1.4. Очистка бидистиллированной воды

Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

7.2.1. Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и очищенную воду.

7.2.1.1. Приготовление 3,1 мМ раствора ортофосфорной кислоты

В мерную колбу объемом 2,0 куб. дм помещают 500 куб. см очищенной воды и 0,42 куб. см концентрированной (85%) ортофосфорной кислоты, перемешивают, доводят до метки очищенной водой и еще раз перемешивают.

7.2.1.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 650 куб. см ацетонитрила и 350 куб. см 3,1 мМ раствора ортофосфорной кислоты в очищенной воде. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор с концентрацией Фамоксадона 1,0 мг/куб. см

Взвешивают 100 мг Фамоксадона в мерной колбе объемом 100 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.2.2.2. Стандартный раствор с концентрацией Фамоксадона 10,0 мкг/куб. см.

Из стандартного раствора Фамоксадона с концентрацией 1,0 мг/куб. см отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании.

7.2.2.3. Стандартные растворы Фамоксадона с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для построения калибровочной кривой и внесения в образцы сока

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см и используют эти растворы для хроматографического исследования.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Фамоксадона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации Фамоксадона. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений (рисунок 1 - не приводится).

7.4.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак Амин для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак Амин устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают последовательно 10 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 1:1 и 10 гексана. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.1.1. Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на концентрирующем патроне Диапак Амин

Из стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 и двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 и последовательно вносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции собирают в отдельные концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, объединяют их и рассчитывают объем растворителя, необходимого для вымывания вещества из патрона.

7.5.2. Подготовка концентрирующего патрона Диапак С16 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин. При работе на патронах Диапак С16 используют очищенную воду.

Патрон Диапак С16 устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1 и 20 куб. см воды. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона!

7.5.2.1. Проверка хроматографического поведения Фамоксадона на концентрирующем патроне Диапак С16

Из стандартного раствора Фамоксадона в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:4 и смесь вносят на патрон. Элюат выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Концентратор вновь обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:2 и смесь вносят на патрон. Элюат выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 мл ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор еще раз обмывают двумя порциями по 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюат после прохождения каждой порции выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Фамоксадон, объединяют их и рассчитывают объем растворителя, необходимого для вымывания вещества из патрона.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 часа.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также с ГОСТ 25892-83 "Виноградный сок, ТУ".

Пробы соков хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре +4 °С не более 10 суток.

9.1.1. Экстракция

Образец виноградного сока массой 10 г помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, прибавляют 100 мл дистиллированной воды, 10 г сухого хлорида натрия, 50 мл диэтилового эфира и интенсивно встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, а верхний эфирный слой с эмульсией - в химический стакан объемом 200 куб. см. Затем водный слой возвращают в делительную воронку и повторяют экстракцию еще 2 раза в тех же условиях, используя по 30 куб. см диэтилового эфира. Эфирный экстракт объединяют в химическом стакане, а водную фазу отбрасывают.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Эфирный экстракт возвращают в делительную воронку, прибавляют туда же 100 мл дистиллированной воды, 10 г сухого хлорида натрия и интенсивно встряхивают воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний водный слой отбрасывают, а верхний эфирный собирают в концентратор объемом 250 куб. см через слой безводного сульфата натрия. Осушитель обмывают 10 мл диэтилового эфира, смыв объединяют с основным экстрактом и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.3. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Амин и Диапак С16

9.1.3.1. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак Амин

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона, помещают на 10 секунд в ультразвуковую ванну и обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см гексана, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Концентратор тщательно обмывают двумя порциями смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 по 10 и 5 куб. см и также вносят на патрон. Элюаты собирают, объединяют, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

9.1.3.2. Очистка экстракта на концентрирующем патроне Диапак С16

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и тщательно обмывают стенки концентратора. Затем в концентратор добавляют 9 куб. см воды, смесь тщательно перемешивают и полученный раствор вносят на патрон. Элюат отбрасывают.

Исходный концентратор обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:4 и смесь вносят на патрон. Элюат отбрасывают.

Исходный концентратор еще раз обмывают 10 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:2 и смесь вносят на патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор обмывают 20 куб. см смеси ацетонитрил - вода в соотношении 1:1 и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 2 - 5 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм.

Предколонка стальная Symmetry С18, 3,9 мм х 2 см, зернением 5 мкм.

Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 3,1 мМ ортофосфорная кислота в соотношении 65:35.

Длина волны 245 нм.

Время удерживания Фамоксадона 10,6 - 11,06 мин.

Чувствительность 0,003 ед. оптической плотности на шкалу.

Объем вводимой пробы 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

После хроматографирования каждой пробы следует промывать колонку не менее 3 минут.

Содержание Фамоксадона рассчитывают по формуле:

где:

X - содержание Фамоксадона в пробе, мг/кг или мг/куб. дм;

Sст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

Sпр - высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г (куб. см);

P - содержание Фамоксадона в аналитическом стандарте, %.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,02 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):