"МУК 4.2.2234-07. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации клеток плесневого гриба Penicillium canescens PlPh33 - продуцента пектинлиазы и фитазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 06.08.2007)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 марта 2007 г. N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 августа 2007 г.

3. Разработаны ГОУ ВПО "Российский государственный медицинский университет".

4. Введены в действие с 1 октября 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium canescens PlPh33 - продуцента пектинлиазы и фитазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".

Штамм мицелиального гриба Penicillium canescens PlPh33 является продуцентом пектинлиазы и фитазы. Получен из штамма Penicillium canescens ВКПМ F-178 путем селекции. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ F-3867D.

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар) при температуре 25 - 28 °C в течение 5 - 7 сут., pH 5,0 - 6,0. При температуре 5 и 37 °C роста колоний не наблюдается.

На среде Чапека с дрожжевым автолизатом и сусло-агаре колонии достигают максимального диаметра 5 - 6 см. Колонии радиально складчатые, средней плотности, ростовая зона плотная. Мицелий белый, конидиальная зона голубовато-серебристая, конидиогенез обильный. Обратная сторона палевая, буроватая, со временем темно-коричневая.

При микроскопическом исследовании конидиеносцы двухъярусные, терминальные, фуркатные, шероховатые, длиной 150 мкм, шириной 3 - 4 мкм. Метулы шероховатые, размером 10 - 18 x 2,5 - 3,5 мкм, фиалиды ампулиформные, размером 7 - 8 x 2 - 3 мкм, конидии чаще округлые, гладкие, размером 2,2 - 3,0 x 2,0 - 3,0 мкм.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./куб. м, пометка А.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность агаризованной среды и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам на 3-и сут.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

Среда сусло-агар: солодовое сусло 7° Б - 98%, агар-агар - 2%, pH среды - 4,5 - 5,0, режим стерилизации: Р - 0,8 кгс/кв. см, 40 мин. Для приготовления солодового сусла 7° Б солодовый экстракт растворяют в дистиллированной воде до 7% содержания сахара с помощью ареометра.

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают требования:

- санитарных правил СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами";

- правил техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;

- правил электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора;

- руководства "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);

- "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 10 л/мин. на поверхность агаризованной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2 - 3-и сут. после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C, добавляют молочную кислоту из расчета 2 мл на 0,5 л среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры, pH 5,0 - 6,0), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 28 °C. Через 3 - 4 сут. проводят подсчет выросших типичных по морфологическим признакам колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

При микробиологическом анализе воздуха производственных помещений дополнительным функциональным методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с агаризованной средой. После отбора проб чашки покрывают слоем 2%-го водного пектина толщиной 0,5 см. Затем инкубируют в термостате при 28 °C в течение 48 - 72 ч и подсчитывают количество зон осветления и разложения пектина вокруг выросших колоний.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с "Требованиями к ростовым свойствам питательных сред" (Государственная фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2. С. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 - 3 чашки каждой используемой среды.

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха проводят по формуле:

где:

X - концентрация клеток продуцента в воздухе, кл./куб. м;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

Результаты измерений оформляют протоколом по приведенной форме.

Ответственный исполнитель:

Научный руководитель:

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

5. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. С. 122.