"МУК 4.2.2656-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.07.2010)

1. Разработаны Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования "Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию", Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПАКК РАСХН).

2. Рекомендованы Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 июля 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171, селекционированного в ГУ ВНИИ пищевых ароматизаторов, кислот и красителей РАСХН (ГУ ВНИИПАКК), в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля концентрации конидий штамма Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе производственных помещений биотехнологического производства лимонной кислоты и оценки соответствия уровня их содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования", ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений" и Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 относится к микромицетам. Уже на 2-е сутки на поверхности среды Чапека или сусло-агара при температуре 32 °C клетки (кл.) образуют округлые колонии диаметром 2,0 см с плоским субстратным мицелием, аспорогенные. На 5-е сутки роста они достигают максимального диаметра в среднем 8,1 см на среде Чапека и 8,6 см - на сусло-агаре. Окраска гигантской колонии бежевая - на среде Чапека, светло-бежевая - на сусло-агаре. Воздушный мицелий сильно развит: от поверхности субстратного мицелия вертикально поднимаются несептированные клетки - конидиеносцы. Минимальная длина конидиеносца 48 мкм, максимальная - 1265 мкм. Диаметр поперечного сечения конидиеносца - от 9 до 20 мкм. Верхний конец конидиеносца расширяется, образуя вздутие - пузырек диаметром от 20 до 60 мкм. От поверхности пузырька синхронно образуются цилиндрические выросты - стеригмы двуслойной структуры. От каждой стеригмы первого слоя отделяются, в основном, две вторичные стеригмы. Стеригмы первого слоя вдвое крупнее, чем стеригмы второго слоя. Длина стеригм первого слоя - от 6 до 32 мкм, второго слоя - от 5 до 10 мкм. Стеригмы второго слоя образуют цепочки конидий, созревание которых начинается на вторые сутки. Конидии имеют шарообразную форму, диаметр - 4,1 мкм, толстую пигментированную оболочку с шипами. Вздутие конидиеносца, стеригмы и конидии являются составляющими конидиальной головки, диаметр сечения которой колеблется от 44 до 132 мкм. В центре колонии конидиальные головки расположены плотно. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,5 см - на среде Чапека и 0,6 см - на сусло-агаре наблюдается светлая зона с незрелыми белыми конидиальными головками, плотно прижатыми к субстратному мицелию. Обратная сторона колонии гладкая, белая.

Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-171 получен в ГУ ВНИИПАКК методом мутагенеза из штамма Aspergillus niger Л-1 с использованием химических мутагенов и УФ-облучения в сочетании с отбором спонтанных вариантов и депонирован в ВКПМ как продуцент лимонной кислоты.

Штамм растет на жидких агаризованных средах. Оптимальная температура - от 28 до 32 °C. Для размножения используется сусло-агар (значение Баллинга 7°).

Методика позволяет выполнить измерения количества клеток продуцента лимонной кислоты в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м.

Метод измерения концентрации конидий штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 основан на аспирации из воздуха конидий микромицета на поверхность среды Чапека или сусло-агар, подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2-е сутки роста и контроля их развития на 5-е сутки роста.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

При выполнении измерений концентрации конидий продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны соблюдают:

- правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов;

- требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);

- положения инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (1977);

- санитарные правила по работе с микроорганизмами СП 1.3.2322-08;

- требования безопасности при работе с продуцентом лимонной кислоты, изложенные в инструкции по контролю производства лимонной кислоты (1997).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Измерение концентрации конидий штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны проводят с помощью прибора "Фора-100" при температуре окружающей среды от 0 до 50 °C и относительной влажности воздуха не более 80%.

Определение концентрации конидий микромицета Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе производственных помещений проводят в результате их аспирации на плотную питательную среду Чапека или сусло-агар с последующей инкубацией в термостате и подсчетом выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

Аспирацию воздуха проводят с интервалом 2 мин. и отбирают по 5 проб (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин.) в каждой точке контроля. Выбор точек контроля определяется в соответствии с МУК 4.2.734-99.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора по форме:

Агаризованную среду Чапека (сухой бакто-агар Czapek готовят согласно документации фирмы-производителя) или сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °C и разливают в стерильные чашки Петри по 20 куб. см. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C на сутки, после чего проросшие чашки бракуют.

После отбора проб воздуха на чашки Петри их помещают в термостат при температуре 32 °C на 48 ч, по истечении которых производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. Микроскопирование культуры проводят с помощью микроскопа биологического с иммерсионной системой типа МБИ-15 в следующих условиях: объектив - планапохроматический; увеличение - 40,0 x 0,65; система - сухая; поле зрения с окуляром 10x в плоскости объекта 1,14 мм; рекомендуемый окуляр - К-6,3x.

Расчет концентрации микробных клеток Aspergillus niger ВКПМ F-171 в 1 куб. м воздуха выполняют на основании 5 проб, полученных при разном времени аспирации (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин.) в каждой точке контроля, и производят по формуле:

где:

K - концентрация клеток продуцента в воздухе, кл./куб. м;

П - количество колоний продуцента, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета 1 куб. дм в 1 куб. м воздуха;

C - скорость аспирации, куб. дм/мин.;

t - время аспирации, мин.

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Ответственный исполнитель __________________________________

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны". М.: Стандартинформ, 1988. 49 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96 "Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений". М.: Госстандарт России, 1997. 19 с.

3. Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда". М.: Госстандарт России, 2005. 40 с.

4. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

5. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

6. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитных болезней". М.: Минздрав России, 2008. 19 с.

7. ИК 01-00334557-97 "Инструкция по биологическому и химическому контролю производства пищевой лимонной кислоты". СПб.: ВНИИПАКК, 1997. 268 с.