"МУК 4.1.2299-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Бифентрина в зерне кукурузы, семенах подсолнечника и растительных маслах методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 25.10.2007)

1. Разработаны: Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 21.06.2007 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 25 октября 2007 г.

4. Введены в действие с 25 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Бифентрина в зерне кукурузы, семенах подсолнечника и растительных маслах в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Фирма производитель: ФМС Европа НВ.

Торговое название: Семафор.

Название действующего вещества по ИСО: Бифентрин.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 2-метил-3-илметил(Z)-(1RS, 3RS)-3-(2-хлор-3,3,3-трифторпроп-1-енил)-2,2-диметилциклопропанкарбоксилат.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 422,9.

Изомерный состав: цис-изомер - 97% (минимум), транс-изомер - 3% (максимум).

Химически чистое соединение представляет собой белый кристаллический порошок.

Физическое состояние технического продукта - вязкая, затвердевающая маслянистая жидкость.

Давление насыщенного пара 0,024 мПа при 25 °C.

Температура плавления: 51 - 66 °C (технического продукта), 68 - 70 °C (чистого химического вещества).

Плотность при 25 °C: 1,210 г/куб. см.

Плохо растворим в гептане, метаноле, воде, относительно хорошо растворим в н-гексане и хорошо в ацетоне, хлороформе, дихлорметане, диэтиловом эфире и толуоле.

Стабилен в водной среде при pH от 5,0 до 9,0. Он долго сохраняется на обработанных поверхностях в отсутствии света и относительно фотостабилен.

Период полураспада в почве от 2 до 4 месяцев (в зависимости от типа почвы).

В России установлены следующие гигиенические нормативы

ДСД - 0,005 мг/кг/сут.

ВМДУ (мг/кг): кукуруза (зерно), подсолнечник (семена) - содержание вещества не допускается в данных продуктах (на уровне чувствительности метода контроля).

МДУ в растительных маслах не установлен.

Бифентрин - инсектицид и акарицид контактного и кишечного действия из группы синтетических пиретроидов, эффективно подавляет развитие вредителей из отрядов жесткокрылых, прямокрылых, двукрылых и чешуекрылых (имаго и личинки), а также некоторых видов клещей.

Зарегистрирован в России и странах СНГ под торговым названием Семафор, ТПС, 200 г/л, для применения на подсолнечнике, кукурузе и сахарной свекле против проволочников с нормой расхода от 2 - 2,5 кг/га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на определении Бифентрина методом капиллярной газожидкостной хроматографии с электронозахватного детектора после экстракции веществ органическим растворителем, очистки экстрактов путем перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями и дополнительной очистки на колонках с Флоризилом.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Весы аналитические СИГМА 11140, фирма "OHAUS".

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г V600, "ACCULAB".

Колбы мерные вместимостью 10, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц Гамильтон вместимостью 10 куб. мм.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100 и 250 куб. см, ГОСТ 1770.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аналитический стандарт Бифентрина с содержанием 99,6% д.в. (фирма ФМСи).

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

Н-гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Гелий очищенный марки "А", ТУ-51-940-80.

Натрий сернокислый, безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 - 80 меш, фирма "Мерк".

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Стандартный раствор Бифентрина в ацетоне с концентрацией 1,0 мг/куб. см (хранить в холодильнике, срок годности 120 суток).

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Аппарат для встряхивания проб TYP LT1 фирмы "SKLO UNION".

Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Ванна ультразвуковая "UNITRA" UNIMA OLSZTYN UM-4.

Воронки химические для фильтрования, стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480.

Концентраторы грушевидные на 100 и 250 куб. см, НШ 29 КГУ-100 (250), ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-1, метилсиликон, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирмы Хьюлетт Паккард.

Стаканы химические емкостью 50, 100 и 250 куб. см, ГОСТ 25336-82Е.

Насос вакуумный диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ 6-09-2678-77.

Центрифуга MPW-350e с набором полипропиленовых банок емкостью 200 мл.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К подготовке проб допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7.1.1. Подготовка хроматографической колонки, заполненной Флоризилом, для очистки проб.

На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 10 см, диаметр 1,5 см) помещают пробочку из стекловаты и заполняют колонку Флоризилом на высоту 5 см. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 см. Колонку промывают последовательно 10 куб. см этилацетата (остаток растворителя в колонке отжимают) и 10 куб. см гексана, смывы отбрасывают. После промывки колонка готова к работе.

7.1.2. Проверка хроматографического поведения Бифентрина на колонках с Флоризилом.

При отработке методики или поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения Бифентрина на колонке. В стакан емкостью 50 куб. см помещают 1 куб. см стандартного раствора Бифентрина в ацетоне с концентрацией 0,1 мкг/куб. см, добавляют 4 куб. см гексана, перемешивают содержимое и наносят на колонку. Промывают колонку 20 куб. см гексана, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 25 куб. см смеси гексан:этилацетат - 9:1, отбирая последовательно по 5 куб. см элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторах растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм. По результатам обнаружения Бифентрина в каждой фракции определяют объем смеси гексан:этилацетат - 9:1, необходимый для полного вымывания Бифентрина.

Взвешивают 100 мг Бифентрина в мерной колбе на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1, концентрация 1,0 мг/куб. см).

Стандартный раствор N 1 можно хранить в холодильнике в течение 3 месяцев.

Методом последовательного разбавления из раствора N 1 готовят стандартные растворы Бифентрина в ацетоне с концентрацией 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см для построения калибровочного графика и количественной оценки проб, которые могут храниться в холодильнике не более 1 месяца.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Бифентрина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 0,01; 0,02; 0,05 и 0,1 мкг/куб. см.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Бифентрина в растворе в мкг/куб. см.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 1129-93 "Масло подсолнечное. ТУ"; ГОСТ 8808-91 "Масло кукурузное. ТУ"; ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и отбора проб"; ГОСТ 13634-90 "Кукуруза".

9.1.1. Экстракция.

Навеску измельченных семян 10 г помещают в полипропиленовую банку объемом 250 куб. см, добавляют 40 куб. см ацетона и помещают в ультразвуковую ванну на 10 минут. По окончании экстракции экстракт центрифугируют 4 минуты при 4000 об./мин. и супернатант сливают в колбу емкостью 250 куб. см через воронку с бумажным фильтром. Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 30 куб. см ацетона, помещая смесь в ультразвуковую ванну соответственно на 5 минут. Экстракты объединяют.

Из объединенного экстракта отмеряют точно 50 куб. см, переносят в концентратор и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C до маслянистого остатка. В концентратор добавляют 30 куб. см гексана, тщательно обмывают стенки концентратора и переносят в делительную воронку. Обмывают концентратор еще 20 куб. см гексана и гексановые фракции объединяют в делительной воронке.

Приливают в воронку 50 куб. см ацетонитрила, встряхивают ее в течение одной минуты. После разделения слоев нижний ацетонитрильный слой сливают в концентратор емкостью 250 куб. см, а верхний гексановый слой возвращают в делительную воронку. Повторяют экстракцию еще 2 раза, используя для этого каждый раз по 30 куб. см ацетонитрила. Экстракты объединяют, а гексановую фракцию отбрасывают.

9.1.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Объединенный экстракт выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторе разводят в 5 куб. см ацетона, ополаскивают стенки концентратора, добавляют 100 куб. см воды и переносят водную фазу в делительную воронку.

Добавляют 30 куб. см гексана и интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой сливают в стакан, а верхний гексановый собирают в чистый концентратор емкостью 250 куб. см, пропуская через слой безводного сульфата натрия. Повторяют экстракцию еще два раза с тем же объемом гексана. Объединенный экстракт выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °C.

9.1.3. Очистка экстракта на колонке с Флоризилом.

Сухой остаток в концентраторе, полученный по разделу 9.1.2, растворяют в 5 куб. см гексана, омывая стенки концентратора, и наносят на заранее подготовленную, как указано в разделе 7.1.1, колонку с Флоризилом, элюат отбрасывают. Колонку промывают 20 куб. см гексана, элюат отбрасывают. Пропускают через колонку 15 куб. см смеси гексан:этилацетат в соотношении 9:1, элюат собирают в концентратор емкостью 100 куб. см. Содержимое концентратора выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 30 °C.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 куб. см ацетона и 1 куб. мм вводят в хроматограф.

Навеску масла 10 г растворяют в 50 куб. см гексана и переносят в делительную воронку. Добавляют в делительную воронку 40 куб. см ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 2 минут. После полного разделения слоев нижний (ацетонитрильный) слой собирают в концентратор 250 куб. см. Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 40 куб. см ацетонитрила, встряхивая смесь каждый раз по 2 минуты. Экстракты объединяют.

Далее проводят очистку экстракта, как указано в разделе 9.1.2 и 9.1.3.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая HP-1, Methyl Siloxane, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 300 °C, испарителя - 270 °C, программированный нагрев колонки с 210 °C (выдержка 2 мин.) по 10 град./мин. до 270 °C (выдержка 2 мин.).

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, режим нормальный, скорость 20 см/с, давление 99,78 кПа.

Газ 2 (гелий) - 15 мл/мин.: расход 0,5 мл/мин., сброс 1:30.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 45 мл/мин.

Абсолютное время удерживания: 8 мин. 10 сек. +/- 2%.

Линейность детектирования сохраняется в пределах - 0,01 - 0,1 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю сумму площадей характерных пиков Бифентрина.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Бифентрина рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):