"МУК 4.1.2168-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Клопиралида в капусте, семенах и масле рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2007)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Клопиралида в капусте в диапазоне 0,025 - 0,25 мг/кг; а также в семенах и масле рапса в диапазоне 0,25 - 2,5 мг/кг.

Фирма-производитель: Дау АгроСаенсес.

Торговое название: Лонтрел-300, Лонтрел гранд.

Название действующего вещества по ИСО: Клопиралид.

Название по ИЮПАК: 3,6-дихлорпиридин-2-карбоновая кислота.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,15 мг/кг/сутки;

МДУ в капусте - 0,05; в рапсе (семена и масло) - 0,5 мг/кг.

Клопиралид - гербицид из группы производных пиколиновой кислоты системного действия, нарушает ауксиновый обмен, вызывая сильное искривление стеблей и черенков листьев. Он эффективно уничтожает однолетние и многолетние двудольные сорняки, в том числе устойчивые к 2,4-Д, главным образом из семейства сложноцветных и гречишных: ромашку, осот полевой, бодяк полевой, латук татарский, одуванчик, виды горца и др.

Производится фирмой Дау АгроСаенсес в виде водного раствора с содержанием действующего вещества 300 г/л и водно-диспергируемых гранул с содержанием действующего вещества 750 г/кг.

Зарегистрирован в России под торговым названием Лонтрел-300 и Лонтрел гранд для борьбы со всеми видами ромашки, горца и осота. На рапсе яровом и озимом применяется с нормой расхода 90 г д.в. на га путем опрыскивания посевов в фазе 3 - 4 листьев культуры, а на капусте - с нормой расхода 60 - 150 г д.в. на га путем опрыскивания сорняков после высадки рассады.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на определении Клопиралида методом капиллярной ГЖХ с использованием детектора по захвату электронов после экстракции его из семян и масла рапса, растений капусты ацетонитрилом, подкисленным концентрированной соляной кислотой до pH = 1, переэкстракции в эфир с последующим бутилированием.

Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001, или аналогичные.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г, ГОСТ 19491-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц на 10 куб. мм, ТУ 2.833.106.

Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аналитический стандарт Клопиралид с содержанием 98,6% д.в. (фирма Дау АгроСаенсес).

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Ацетон, х.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил, ТУ 6-09-3534-87.

н-Бутанол, х.ч., ГОСТ 6006-78, свежеперегнанный.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Гелий очищенный марки "А", ТУ 51-940-80.

Кислота серная концентрированная, ч., ГОСТ 4204-77.

Кислота соляная концентрированная, х.ч., ГОСТ 3118-77.

Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрия гидрокарбонат, х.ч, ГОСТ 4201-89.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Стандартный раствор Клопиралида в ацетоне - 1 мг/куб. см (хранить в холодильнике, срок годности 120 суток).

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Аппарат для встряхивания проб АВУ-1, ТУ 64-1-1081-73.

Блок нагревательный для виал, Dri-Block DB-3, Tecam.

Ванна ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Виалы с тефлоновыми прокладками, Aldrich, cat. N Z27,702-9.

Воронки химические для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rotavapor R110 Buchi с водяной баней В-480, фирма Буши.

Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 куб. см, КПШ-100, КПШ-250, ГОСТ 10394-72.

Концентраторы грушевидные (конические) 250 куб. см, ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5, (Crosslinked, 5% фенилсилоксана и 95% метилсилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирмы Хьюлетт Паккард.

Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Мельница лабораторная электрическая, ТУ 46-22-236-84, или аналогичная.

Стаканы стеклянные на 100 куб. см, ГОСТ 6236-72.

Фильтры бумажные "Красная лента", ТУ 6-09-1678-86.

Центрифуга MPW-350e с набором полипропиленовых банок емкостью 200 куб. см.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные и технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7.1.1. Приготовление подкисленного ацетонитрила

Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

1000 куб. см ацетонитрила наливают в стеклянную емкость объемом 1,5 куб. дм. К ацетонитрилу пипеткой добавляют концентрированную соляную кислоту до pH ~= 1.

7.1.2. Приготовление раствора для бутилирования

Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

В мерную колбу объемом 100 куб. см осторожно приливают 2 куб. см концентрированной серной кислоты к н-бутанолу. Перемешивают раствор и доводят объем до метки бутанолом. Бутилирующую смесь хранят под тягой в течение одного месяца. Перед приготовлением раствора н-бутанол перегоняют.

7.1.3. Приготовление 4 н водного раствора серной кислоты

Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

В мерную колбу объемом 1 куб. дм наливают около 500 куб. см дистиллированной воды и осторожно приливают 112 куб. см концентрированной серной кислоты. Осторожно перемешивают раствор, добавляют воды, но не до метки. Когда раствор остынет, его доводят водой до метки.

7.1.4. Приготовление 5%-ного раствора гидрокарбоната натрия

В стакан на 500 куб. см помещают 50 гидрокарбоната натрия. Доливают около 200 куб. см воды и растворяют соль на ультразвуковой ванне, помешивая стеклянной палочкой. Раствор переливают в мерную колбу объемом 1 куб. дм. При необходимости процедуру повторяют. Раствор в колбе доводят водой до метки.

7.1.5. Приготовление стандартных растворов

100 мг Клопиралида (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/куб. см). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Методом последовательного разбавления исходного раствора N 1 ацетоном готовят стандартный раствор N 2 с концентрацией 10,0 мкг/куб. см, который может храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.1.6. Приготовление стандартных растворов бутилового эфира Клопиралида

Стандартные растворы бутилового эфира Клопиралида используют для построения градуировочного графика. Отбирают 1 куб. см стандартного раствора N 2 в виалу, удаляют растворитель током теплого воздуха и проводят бутилирование, как указано в разделе 9.1.2. Получают стандартный раствор N 3 бутилового эфира Клопиралида с концентрацией 1,0 мкг/куб. см по кислоте. Из него последовательным разбавлением в гексане готовят рабочие растворы с концентрациями: 0,25; 0,1; 0,05; 0,025 мкг/куб. см.

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа последовательно вводят по 1 куб. мм каждого рабочего раствора бутилового эфира Клопиралида с концентрацией по кислоте 0,25; 0,1; 0,05; 0,025 мкг/куб. см. Проводят не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Клопиралида в растворе в мкг/куб. см (рисунок 1 - не приводится).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ", ГОСТ 1724-85 "Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. ТУ".

Пробы капусты хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С в течение до 3-х суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре -18 °С до 2-х лет.

Пробы семян рапса подсушивают до стандартной влажности и хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов, в течение 1 года.

Пробы масла рапса хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С не более 30 дней.

Для исследовательских целей допускается получение масла в лаборатории из проб семян методом экстракции горячим растворителем при температуре не выше 40 °С.

9.1.1. Экстракция и очистка

Навеску размолотых семян рапса 10 г помещают в центрифужную банку объемом 250 мл, добавляют 40 куб. см подкисленного ацетонитрила и встряхивают смесь на встряхивателе в течение 45 минут. По окончании встряхивания пробу центрифугируют 10 минут при 4000 об./мин. Фильтруют экстракт в концентратор емкостью 250 куб. см через воронку с бумажным фильтром. Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 30 куб. см подкисленного ацетонитрила, встряхивая смесь каждый раз по 30 минут. Экстракты объединяют.

Из объединенного экстракта отбирают аликвоту 1/10 часть (10 куб. см), которую выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С до капель масла.

К масляному остатку в концентраторе добавляют 5 куб. см ацетона, омывают концентратор и помещают на 5 минут на ультразвуковую ванну. В концентратор двумя порциями добавляют 100 мл воды, ополаскивают стенки концентратора и переносят в делительную воронку.

Добавляют в воронку 5 граммов хлорида натрия, растворяют его путем встряхивания. Водную фазу подкисляют 4 н раствором серной кислоты до pH = 1 (примерно 2 куб. см), добавляют 30 мл эфира и интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой сливают в тот же концентратор, а верхний эфирный собирают в плоскодонную колбу емкостью 100 куб. см. Водную фракцию возвращают в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще дважды, используя для этого каждый раз 30 куб. см эфира. После этого водную фракцию отбрасывают.

Эфирные фракции объединяют и переливают в ту же делительную воронку. К эфиру в воронку добавляют 40 куб. см 5%-ного раствора гидрокарбоната натрия, интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний слой соды собирают в плоскодонную колбу на 100 куб. см. Экстракцию повторяют еще раз, используя 40 куб. см раствора гидрокарбоната натрия. Эфир отбрасывают.

Объединенный содовый экстракт переносят обратно в делительную воронку, дают отстояться, отбрасывают отстоявшийся эфир. После этого раствор в делительной воронке подкисляют 4 н раствором серной кислоты до pH = 1 (17 куб. см). Смесь дегазируют. Приливают 30 куб. см эфира, интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой собирают в плоскодонную колбу, а верхний эфирный переносят в чистый концентратор емкостью 250 куб. см, пропуская через воронку с безводным сульфатом натрия. Водную фракцию возвращают в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще дважды, используя для этого каждый раз 30 куб. см эфира. Эфирные экстракты объединяют в концентраторе и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °С досуха. Сухой остаток переносят тремя порциями по 5 куб. см диэтилового эфира в виалу и высушивают током теплого воздуха. Проводят бутилирование, как указано в пункте 9.1.2.

9.1.2. Бутилирование

К сухому остатку в виалу добавляют 1 куб. см 2%-ного раствора концентрированной серной кислоты в бутаноле. Плотно закрывают виалу крышкой и помещают в блок для виал, нагретый до 100 °С. Бутилирование проводят в течение 30 минут. Далее виалу охлаждают до комнатной температуры, добавляют в нее 10 куб. см гексана, 20 - 25 куб. см дистиллированной воды. Смесь интенсивно встряхивают и после разделения фаз из верхнего гексанового слоя аликвоту 1 куб. мм вводят в хроматограф.

Навеску масла 10 г растворяют в 100 куб. см гексана и переносят в делительную воронку. Добавляют в делительную воронку 50 куб. см подкисленного ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 2 минут. После полного разделения слоев нижний (ацетонитрильный) слой собирают в концентратор 250 куб. см. Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 25 куб. см ацетонитрила, встряхивая смесь каждый раз по 2 минуты. Из объединенного экстракта отбирают аликвоту 1/10 часть и выпаривают ее на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С до капель масла.

Далее проводят очистку пробы с последующим бутилированием, как указано к разделе 9.1.

Навеску измельченного кочна капусты 10 г помещают в центрифужную банку объемом 250 куб. см, добавляют 50 куб. см подкисленного ацетонитрила и встряхивают смесь на встряхивателе в течение 45 минут. Фильтруют экстракт в концентратор емкостью 250 куб. см через воронку с бумажным фильтром. Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 30 куб. см подкисленного ацетонитрила, встряхивая смесь каждый раз по 30 минут. Экстракты объединяют в концентраторе и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С досуха.

К сухому остатку в концентраторе добавляют 5 куб. см ацетона, омывают концентратор и помещают на 5 минут на ультразвуковую ванну. В концентратор двумя порциями добавляют 100 куб. см воды, ополаскивают стенки концентратора и переносят в делительную воронку.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5 (Crosslinked, 5% фенилсилоксана и 95% метилсилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 340 °С, испарителя - 260 °С, программированный нагрев колонки со 160 °С (выдержка 2 минуты) по 5 град./мин. до 220 °С (выдержка 6 минут).

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, режим нормальный, скорость 20 см/с, давление 89,46 кПа.

Газ 2 (гелий) - 120 куб. см/мин.: расход 0,5 куб. см/мин., сброс 1:240.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 45 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания Клопиралида - 7 мин. 14 сек. +/- 2%.

Линейность детектирования сохраняется в пределах - 0,025 - 0,25 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией Клопиралида 0,25 мкг/куб. см, соответственно разбавляют.

Количественное определение Клопиралида проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов Клопиралида с концентрацией 0,025 - 0,25 мкг/куб. см.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Клопиралида рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГОУ ВПО Российский Государственный Аграрный Университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".