"МУК 4.1.2286-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имидаклоприда в ягодах красной и черной смородины, семенах и масле рапса методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 28.09.2007)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 21.06.2007).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Торговое наименование: Танрек, Табу.

Фирма производитель: ЗАО Фирма Август.

Действующее вещество: имидаклоприд.

Структурная формула (не приводится).

1-(6-хлор-3-пиридилметил)-N-нитроимидазолидин-2-илиденамин(IUPAC).

1-[(6-хлор-3-пиридинил)метил]-N-нитро-2-имидазолидинимин(CA).

Имидаклоприд практически не токсичен для птиц, пчел, дождевых червей, водорослей.

Мутагенной и тератогенной активности в стандартных тестах не обнаружено.

Область применения

Имидаклоприд - системный инсектицид нервно-паралитического действия группы неоникотиноидов. Эффективно уничтожает листовую тлю, белокрылку, минеров, трипсов, колорадского жука, долгоносиков на хлопчатнике, рисе, картофеле, кукурузе, сахарной свекле, овощных культурах, цитрусовых, косточковых и семечковых плодовых в течение вегетационного периода. Может использоваться для обработки как почвы, так и надземных органов растений.

Гигиенические нормативы для имидаклоприда в России: для ягод черной и красной смородины, семян и масла рапса гигиенические нормативы в России не установлены.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств имидаклоприда в ягодах смородины, семенах и масле рапса в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методика основана на определении имидаклоприда методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью или органическим растворителем с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами, на колонке с силикагелем и на патронах Диапак С-8.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 6-16-40-14-88.

Ацетон, ос.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.09-1678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-3716-80.

Имидаклоприд, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,9% (Sigma-Aldrich).

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил-вода (20:80, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 - 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (50:50, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (10:90, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка Symmetry C-18, (250 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters).

Предколонка Waters Symmetry C-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001 или аналогичные.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

pH-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Насос водоструйный, МРТУ 42 861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 25336-82Е.

Колбы круглодонные на шлифах КШ10 и КШ250 29-32 ТС, ГОСТ 25336-82Е.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 500 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74Е.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 29169-91.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

Патроны Диапак С-8.

Отбор проб ягод смородины производится в соответствии с ГОСТ 6829-89 "Смородина черная свежая. Требования при заготовке, поставках и реализации". Пробы ягод смородины хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Отбор проб семян рапса производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Масло рапса хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 куб. см растворителя упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °C до объема 1 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

Перед началом анализа колонку (Symmetry C-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

Для получения 75%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 куб. дм смешивают 750 куб. см ацетона и 250 куб. см дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления 1 М раствора NaOH 40 г едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см, растворяют при перемешивании в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

Для приготовления 0,02 М раствора NaOH 20 куб. см 1 М раствора едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Гексан насыщают ацетонитрилом, встряхивая 500 куб. см гексана со 100 куб. см ацетонитрила в делительной воронке объемом 1000 куб. см и отделяя после расслаивания жидкостей верхний гексановый слой.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с водой в соотношении 20:80 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 куб. см смешивают 500 куб. см н-гексана и 500 куб. см этилацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 куб. см смешивают 100 куб. см н-гексана и 900 куб. см этилацетата.

Берут точную навеску имидаклоприда (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - смесь ацетонитрил - вода (20:80, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты извлечения имидаклоприда из ягод черной и красной смородины используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/куб. см готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом. При изучении полноты извлечения имидаклоприда из семян и масла рапса используют растворы вещества в изопропиловом спирте. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/куб. см готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему изопропиловым спиртом.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация имидаклоприда в растворе) в хроматограф вводят по 20 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации имидаклоприда в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

Концентрирующий патрон Диапак С-8 промывают последовательно с помощью шприца 50 куб. см ацетона и затем 50 куб. см воды со скоростью 5 куб. см/мин. После чего он готов к работе.

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 куб. см элюента N 2 и 30 куб. см элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 0,1 куб. см стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 10 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °C), остаток растворяют в 5 куб. см элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 куб. см элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 120 куб. см элюента N 1, которые отбрасывают, затем 100 куб. см элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.6.7.

Фракции, содержащие имидаклоприд, объединяют, упаривают досуха, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.7. Рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания имидаклоприда и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

В мерную колбу емкостью 100 куб. см отбирают 1,0 куб. см стандартного раствора имидаклоприда с концентрацией 0,1 мг/куб. см, растворитель удаляют в токе азота и доводят объем до метки дистиллированной водой и наносят на приготовленный по п. 2.5.6 патрон. Как только уровень жидкости достигнет верхнего края патрона, его промывают 50 куб. см дистиллированной воды, патрон подсушивают током азота со скоростью 150 куб. см/мин. в течение 15 мин. и затем смывают имидаклоприд 70 куб. см ацетона. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, упаривают, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание имидаклоприда по п. 2.6.7. Суммируя результаты, рассчитывают содержание имидаклоприда в элюате, определяя полноту вымывания вещества из патрона и необходимый для очистки экстракта объем элюента.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями стандартов и технической документации.

Образец предварительно гомогенизированных ягод черной смородины помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см с притертой пробкой, добавляют 100 куб. см 75%-го водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 куб. см 75%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты испаряют до водного остатка (30 - 35 куб. см) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C, доводят объем экстракта до 100 куб. см дистиллированной водой.

Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5 (ягоды красной смородины) или 2.6.4 (ягоды черной смородины).

Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян рапса массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см, приливают 100 куб. см ацетонитрила и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 куб. см ацетонитрила. Объединенные экстракты выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды, выдерживая его в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

Образец масла массой 20 г растворяют в 100 куб. см гексана, насыщенного ацетонитрилом, помещают раствор в делительную воронку объемом 250 куб. см и переэкстрагируют имидаклоприд трижды ацетонитрилом, порциями по 50 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 минут и собирая нижний ацетонитрильный слой. Объединенный экстракт промывают дважды гексаном порциями по 20 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 минут. Верхний гексановый слой отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды, выдерживая его в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

Полученный по п. 2.6.1 раствор количественно переносят в подготовленный по п. 2.5.5 патрон Диапак С-8. Колбу обмывают еще 5 куб. см дистиллированной воды и также переносят на патрон (не допускать пересыхания патрона!). Патрон промывают 50 куб. см дистиллированной воды. Патрон подсушивают в токе азота со скоростью 150 куб. см/мин. в течение 15 мин. Имидаклоприд смывают 50 куб. см ацетона. Элюат собирают, выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 100 куб. см дистиллированной воды, выдерживая его в течение 15 мин. на ультразвуковой ванне. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

Полученные по п. п. 2.6.1 - 2.6.4 водные экстракты промывают в делительной воронке объемом 250 куб. см трижды гексаном порциями по 30 куб. см (верхний органический слой отбрасывают), встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 1 - 2 минут. Водную фазу экстрагируют трижды хлористым метиленом порциями по 30 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая нижний органический слой <*>. Объединенный экстракт промывают в делительной воронке дважды 0,02 М раствором NaOH порциями по 30 куб. см, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 куб. см хлористого метилена. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.6 <**>.

--------------------------------

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку: на стадии промывки экстрактов гексаном - небольшое количество (до 5 куб. см) этилового спирта, а на стадии переэкстракции - насыщенный раствор хлорида натрия (15 - 20 куб. см).

<**> В случаях, когда очистка экстрактов контрольных проб дает удовлетворительные результаты дополнительную очистку на колонке с силикагелем можно исключить.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.5 экстрактов, количественно переносят двумя порциями смеси гексан-этилацетат (50:50, по объему) по 5 куб. см в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 120 куб. см элюента N 1. Элюат отбрасывают. Имидаклоприд элюируют 70 куб. см элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 куб. см. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 20 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы Waters с УФ детектором (Waters 2487) или другой с аналогичными характеристиками.

Рабочая длина волны 268 нм.

Предколонка Waters Symmetry C-18 для защиты аналитической колонки.

Колонка Symmetry C-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA).

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в соотношении 20:80. Скорость потока 1 куб. см/мин. Время удерживания имидаклоприда 11,9 +/- 0,2 мин.

Объем вводимой пробы 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,0 мкг/куб. см.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание имидаклоприда в образцах ягод красной и черной смородины, семенах и масле рапса (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств имидаклоприда в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор имидаклоприда 2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг*, где * - 0,005 мг/кг - предел обнаружения).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.