"МУК 4.1.2301-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Ципродинила в винограде и виноградном соке методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 25.10.2007)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения (протокол от 21.06.2007 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 25 октября 2007 г.

4. Введены в действие с 25 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Ципродинила в ягодах и соке винограда в диапазоне 0,02 - 0,2 мг/кг.

Фирма-производитель: Сингента.

Торговое название: Хорус.

Название действующего вещества по ИСО: Ципродинил.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 4-циклопропил-6-метил-N-фенилпиримидин-2-амин.

Структурная формула (не приводится).

Ципродинил является среднестойким соединением в растениях и почве с периодом полуразложения в почве 20 - 60 дней. В растениях метаболизируется посредством гидроксилирования 6-метильной группы, а также пиримидинового и фенильного ядра.

Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки глаз.

В России установлены следующие гигиенические нормативы: ДСД - 0,02 мг/кг/сут.; МДУ в плодах семечковых и косточковых культур - 0,4 мг/кг.

Ципродинил - системный фунгицид, хорошо проникающий в растение через листья и передвигающийся преимущественно по ксилеме. Эффективно подавляет рост мицелия различных патогенов, таких как мучнистая роса, плодовая гниль и парша плодовых культур, в том числе их расы, устойчивые к фунгицидам из групп триазолов, имидазолов и др. В рекомендуемых дозах не оказывает отрицательного действия на растения.

Препарат Хорус, ВДГ, 750 г/кг, зарегистрирован в России в качестве фунгицида для применения в садах плодовых семечковых и косточковых культур с нормой расхода 0,2 - 0,35 кг/га при 2-кратном применении в течение сезона с интервалом между обработками 7 - 10 дней и сроком ожидания 15 дней до уборки. Проходит Государственные регистрационные испытания на виноградниках с нормой расхода до 0,7 кг/га при 3-кратном применении.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на определении Ципродинила методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора после экстракции веществ органическим растворителем, очистки экстрактов путем перевода соединений в ионизированную форму, последующего перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями и дополнительной очистки на колонках с Флоризилом.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Весы аналитические СИГМА 11140, фирма "OHAUS".

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г V600, "ACCULAB".

Колбы мерные вместимостью 10, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц Гамильтон вместимостью 10 куб. мм.

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100 и 250 куб. см, ГОСТ 1770.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аналитический стандарт Ципродинила с содержанием 99,9% д.в. (фирма Сингента).

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Ацетон, ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Ацетонитрил, х.ч., ТУ 6-09-06-1092-83.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Гелий очищенный марки "А", ТУ-51-940-80.

Метилен хлористый, х.ч., ГОСТ 19433-88.

Натрий сернокислый, безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 - 80 меш, фирма "Мерк".

Стандартный раствор Ципродинила в ацетоне - 1 мг/куб. см (хранить в холодильнике, срок годности 120 суток).

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Аппарат для встряхивания проб TYP LT1 фирмы "SKLO UNION".

Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Воронки химические для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней В-480.

Концентраторы круглодонные на 100 и 250 куб. см, НШ 29 КГУ-100 (250), ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая CP SIL 8CD DF = 0,25 UM (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан, аналог НР-5), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирма VARIAN.

Стаканы химические емкостью 50, 100 и 250 куб. см, ГОСТ 25336-82Е.

Насос вакуумный диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ 6-09-2678-77.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К подготовке проб допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7.1.1. Подготовка хроматографической колонки, заполненной Флоризилом, для очистки проб

На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 10 см, диаметр 1,5 см) помещают пробочку из стекловаты и заполняют колонку Флоризилом на высоту 5 см. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 см. Колонку промывают последовательно 15 куб. см ацетона (остаток растворителя в колонке отжимают) и 15 куб. см гексана. Смывы отбрасывают и оставляют колонку на сутки до полного высыхания.

7.1.2. Проверка хроматографического поведения Ципродинила на колонках с Флоризилом

При отработке методики или поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения Ципродинила на колонке. В стакан емкостью 50 куб. см помещают 1 куб. см стандартного раствора Ципродинила в гексане с концентрацией 1 мкг/куб. см, добавляют 4 куб. см гексана, перемешивают содержимое и наносят на колонку. Пропускают через колонку 25 куб. см смеси гексан:ацетон - 9:1, отбирая последовательно по 5 куб. см элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С досуха.

Сухой остаток в концентраторах растворяют в 1 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм. По результатам обнаружения Ципродинила в каждой фракции определяют объем смеси гексан:ацетон - 9:1, необходимый для полного вымывания Ципродинила.

7.2. Приготовление рабочих растворов

7.2.1. Приготовление 2% раствора безводного сульфата натрия

Навеску 2 г безводного сульфата натрия вносят в мерную колбу вместимостью 1 куб. дм, добавляют 600 - 700 куб. см дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения соли и доводят водой до метки.

7.3. Приготовление стандартных растворов

Навеску 50 мг Ципродинила (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 50 куб. см, растворяют в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/куб. см). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Методом последовательного разбавления исходного раствора N 1 ацетоном готовят рабочие растворы Ципродинила с концентрацией 0,10; 0,25; 0,50; 1,00 мкг/куб. см для построения калибровочного графика и для внесения в образцы, которые могут храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.4. Построение градуировочного графика

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Ципродинила в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 0,1; 0,25; 0,5; 1,0 мкг/куб. см.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Ципродинила в растворе в мкг/куб. см.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также с ГОСТ 25896-83 - "Виноград свежий. ТУ" и ГОСТ 25892-83 - "Виноградный сок. ТУ".

Пробы соков хранят в стеклянной герметично закрытой таре в холодильнике при температуре +4 °С не более 10 суток. Пробы винограда хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °С не более суток. Для длительного хранения пробы винограда замораживают и хранят в полиэтиленовой таре в морозильнике при температуре -18 °С до 2-х лет.

9.1.1. Экстракция Ципродинила из анализируемой пробы

Навеску 10 г измельченной пробы помещают в полипропиленовые банки (флаконы) объемом 250 куб. см, приливают 40 куб. см ацетонитрила и встряхивают в течение 30 мин. По окончании встряхивания экстракт фильтруют в делительную воронку емкостью 250 куб. см через стеклянную воронку с бумажным фильтром "красная лента". Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя каждый раз по 40 куб. см ацетонитрила и встряхивая смесь в течение 15 мин. Экстракты отфильтровывают в ту же делительную воронку.

К объединенному экстракту в делительную воронку приливают 25 куб. см гексана и встряхивают в течение минуты. После разделения слоев нижний слой сливают в стакан емкостью 200 куб. см, а гексан отбрасывают. Экстракт возвращают в делительную воронку и промывают его еще раз 25 куб. см гексана.

Промытый экстракт сливают в концентратор емкостью 250 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка при температуре 40 °С.

9.1.2. Переэкстракция хлористый метилен

Водный остаток в концентраторе разбавляют 50 куб. см 2% раствора безводного сульфата натрия, перемешивают содержимое концентратора и переносят в делительную воронку емкостью 250 куб. см. Обмывают концентратор еще раз 50 куб. см безводного сульфата натрия и сливают в ту же делительную воронку. Приливают в делительную воронку 50 куб. см хлористого метилена и встряхивают воронку в течение 2 минут. После разделения слоев нижний слой сливают в концентратор через воронку с безводным сульфатом натрия.

Экстракцию повторяют еще два раза, используя каждый раз по 50 куб. см хлористого метилена. Экстракты объединят и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С.

Далее проводят очистку пробы на колонках с Флоризилом.

9.1.3. Очистка пробы на колонках с Флоризилом

Сухой остаток в концентраторе разводят в 5 куб. см гексана и наносят на колонку с Флоризилом, подготовленную как указано в разделе 7.1.1. Промывают колонку 5 куб. см смеси гексан:ацетон - 9:1, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 20 куб. см смеси гексан:ацетон - 9:1, собирая элюат в концентратор емкостью 100 куб. см. Содержимое концентратора выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре 40 °С. Сухой остаток в концентраторе разводят в 2 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм пробы.

9.2.1. Экстракция Ципродинила из анализируемой пробы

Пробу сока 10 г помещают в делительную воронку емкостью 250 куб. см, добавляют 20 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия, перемешивают содержимое воронки, приливают 50 куб. см ацетонитрила и встряхивают содержимое воронки в течение двух минут. После разделения фаз нижний слой сливают в стакан емкостью 100 куб. см, а ацетонитрил - в концентратор емкостью 250 куб. см. Водно-солевую фазу из стакана возвращают в делительную воронку и повторяют переэкстракцию Ципродинила в ацетонитрил еще 2 раза, используя каждый раз по 50 куб. см ацетонитрила и встряхивая смесь в течение двух минут.

Экстракты объединяют и упаривают на ротационном вакуумном испарителе до остатка объемом 1 - 2 мл при температуре 40 °С.

9.2.2. Переэкстракция хлористый метилен и очистка экстракта

Остаток в концентраторе разбавляют 50 куб. см 2% раствора безводного сульфата натрия, перемешивают содержимое концентратора и переносят в делительную воронку емкостью 250 куб. см. Обмывают концентратор еще раз 50 куб. см 2% раствора безводного сульфата натрия и сливают в ту же делительную воронку.

Приливают в делительную воронку 40 куб. см хлористого метилена и проводят переэкстракцию Ципродинила, как указано в разделе 9.1.2, и очистку пробы на колонке с Флоризилом, как указано в разделе 9.1.3.

После очистки сухой остаток в концентраторе растворяют в 2 куб. см ацетона и вводят в хроматограф 1 куб. мм пробы.

Капиллярная кварцевая колонка CP SIL 8CD DF = 0,25UM (5% дифенил и 95% диметилполисилоксан, аналог НР-5), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 190 °С, выдержка 1 минута, нагрев колонки по 20 °С в минуту до 260 °С; время анализа - 10 мин.

Температура испарителя - 230 °С, детектора - 300 °С.

Регулятор расхода гелия - РРГ-11.

Газ 1 - гелий (газ-носитель), давление на входе - 120 кПа, линейная скорость - 27,902 см/сек., давление на выходе - 101,3 кПа; поток через колонку - 0,881 куб. см/мин.; мертвое время - 1,79 мин.

Газ 2 - гелий (сброс пробы), расход - 8,8 куб. см/мин.; деление потока - 1:10.

Газ 4 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 30 куб. см/мин.

Газ 5 - водород, расход во время анализа - 11,5 куб. см/мин.

Газ 6 - воздух, расход - 200 куб. см/мин.

Продувка детектора и испарителя азотом после анализа - по 50 куб. см/мин. в течение 3 минут при температуре колонки 250 °С. Расход газов: Г1 - 50; Г2 - 40; Г4 - 40 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания Ципродинила - 6 мин. 10 сек. - 6 мин. 12 сек.

Минимально детектируемое количество Ципродинила в анализируемом объеме - 0,1 нг.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,1 - 1,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией Ципродинила 1,0 мкг/куб. см соответственно, разбавляют.

Для определения содержания Ципродинила в пробах методом ГЖХ используют следующую формулу:

где:

Х - содержание Ципродинила в пробе, мг/кг;

Sст - площадь пика стандарта, мВ;

Sпр - площадь пика образца, мВ;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

Р - содержание Ципродинила в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,02 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,02 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.