"МУК 4.1.2593-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Флурохлоридона в почве, семенах и масле подсолнечника методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 26.03.2010)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 3 от 03.12.2009).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 26 марта 2010 г.

4. Введены в действие с 26 марта 2010 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в почве, семенах и масле подсолнечника массовой концентрации Флурохлоридона в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг.

Название действующего вещества по ИЮПАК: (3RS, 4RS; 3RS, 4SR)-3-хлоро-4-хлорометил-1-(,,-трифторо-m-толил)-2-пирролидинон (соотношение стереоизомеров 3:1).

Структурная формула:

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: бежевый, без запаха.

Температура плавления: 40,9 °C (цис-изомер); 69,5 °C (трансизомер).

Летучесть (давление паров): 0,44 мПа (при 25 °C).

Растворимость в воде при 25 °C: 35,1 (дистиллированная вода); 20,4 (pH 9) мг/л; в органических растворителях: этаноле - 100, керосине - < 5 г/л при 20 °C; растворим в ацетоне, хлорбензоле и ксилоле.

Коэффициент распределения в системе октанол/вода при 25 °C: K_ow log P = 3,36.

Флурохлоридон стабилен к гидролизу при pH 5, 7 и 9 (25 °C); в кислой среде и при повышении температуры разлагается с DT₅₀ (при температуре до 60 °C) - 7 дней (pH 4), 18 дней (pH 7). В водной среде он подвергается фотолизу с DT₅₀ (при pH 7, 25 °C) - 4,3 дня (цис-/трансизомеры). В почве вещество сохраняется относительно долго с DT₅₀ (в лабораторных условиях) до 70 дней.

Краткая токсикологическая характеристика. Флурохлоридон относится к мало опасным веществам по острой пероральной (ЛД₅₀ для крыс - 4000 мг/кг) и острой дермальной токсичности (ЛД₅₀ для кроликов > 5000 мг/кг), но к чрезвычайно опасным по ингаляционной токсичности (ЛС₅₀ (4 часа) для кроликов > 121 мг/м³). Препарат Рейсер, кэ, 250 г/л отнесен к 3-му классу опасности.

В Российской Федерации для Флурохлоридона установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,04 мг/кг/сут.

ОДК в почве - 0,03 мг/кг.

ПДК в воде - 0,04 (с.-т.) мг/дм³.

МДУ в семенах и масле подсолнечника - 0,1 мг/кг.

Флурохлоридон - предвсходовый гербицид, ингибирует синтез каротиноидов, которые препятствуют фотоокислению хлорофилла. В растения проникает через корни, стебли и точки роста. Применяется для борьбы с однолетними двудольными и злаковыми сорняками при возделывании озимой пшеницы, ржи, кукурузы и подсолнечника при нормах расхода 250 - 750 г д.в./га путем опрыскивания почвы до всходов культуры.

Препарат на основе Флурохлоридона применяется в посевах моркови и посадках картофеля - 2 - 3 л/га, а также подсолнечника - 3 - 4 л/га, однократно до всходов культуры.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Флурохлоридона методом капиллярной ГЖХ с использованием детектора по захвату электронов после извлечения его из почвы, семян подсолнечника и гексанового раствора масла ацетонитрилом, переэкстракции в гексан, очистки полученного экстракта от мешающих анализу веществ на концентрирующем патроне Диапак C16 и колонке с Флоризилом.

Идентификацию вещества проводят по времени удерживания путем сравнения с аналитическим стандартом, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Патроны промывают последовательно 10 см³ ацетонитрила и 10 см бидистиллированной воды, не допуская высыхания поверхности патрона.

В концентратор вносят 1 см³ стандартного раствора Флурохлоридона в ацетоне с концентрацией 0,1 мкг/см³, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C. Добавляют в концентратор 1 см³ ацетонитрила и 9 см³ бидистиллированной воды, перемешивают содержимое концентратора, наносят на патрон и пропускают со скоростью не более 2 см³/мин., не допуская высыхания поверхности патрона, смыв отбрасывают. Промывают патрон 20 мл бидистиллированной воды, смыв отбрасывают. Элюируют Флурохлоридон, пропуская через патрон 4 - 5 порций смеси ацетонитрил:вода - 1:1, по 5 см³ каждая, и собирая их в отдельные концентраторы емкостью 100 см³. Собранные фракции выпаривают досуха. Сухой остаток в концентраторах разводят в 1 см³ ацетона и вводят в хроматограф 1 мм³. После введения проб в хроматограф рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смыва с колонки и необходимый объем элюата.

На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 15 см, диаметр 1,5 см) помещают пробочку из стекловаты и заполняют колонку Флоризилом на высоту 10 см. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 см. За день до очистки экстракта колонку промывают последовательно 20 см³ ацетона и 10 см³ гексана, смывы отбрасывают. После промывки колонка готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения Флурохлоридона на колонке. В концентратор вносят 1 см³ стандартного раствора Флурохлоридона в ацетоне с концентрацией 0,1 мкг/см³, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C, добавляют 5 см³ гексана, растворяют содержимое концентратора и наносят на колонку. Промывают колонку 15 см³ гексана, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 10 см³ смеси гексан:ацетон - 4:1, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 20 см³ смеси гексан:ацетон - 1:1, отбирая последовательно по 5 см³ элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторах растворяют в 1 см³ ацетона и вводят в хроматограф 1 мм³. По результатам обнаружения Флурохлоридона в каждой фракции определяют объем смеси гексан:ацетон - 1:1, необходимый для полного вымывания Флурохлоридона.

В коническую колбу объемом 250 см³ отмеряют мерным цилиндром 100 см³ бидистиллированной воды и прибавляют в нее 100 см³ ацетонитрила. Полученную смесь тщательно перемешивают и используют для очистки экстракта на патронах.

В коническую колбу объемом 250 см³ отмеряют мерным цилиндром 100 см³ гексана и прибавляют в нее 100 см³ ацетона. Полученную смесь тщательно перемешивают и используют для очистки экстракта на колонке с Флоризилом.

В коническую колбу объемом 250 см³ отмеряют мерным цилиндром 200 см³ гексана и прибавляют в нее 50 см³ ацетона. Полученную смесь тщательно перемешивают и используют для очистки экстракта на колонке с Флоризилом.

50 мг Флурохлоридона (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 50 см³, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/см³). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Затем 1,0 см³ стандартного раствора N 1 с концентрацией 1,0 мг/см³ отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании (стандартный раствор N 2 с концентрацией Флурохлоридона 10,0 мкг/см³).

Далее 1,0 см³ стандартного раствора N 2 с концентрацией 10,0 мкг/см³ отбирают пипеткой в мерную колбу объемом 100 см³ и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании (стандартный раствор N 3 с концентрацией Флурохлоридона 0,1 мкг/см³).

Методом последовательного разбавления в мерных колбах раствора N 3 ацетоном готовят рабочие растворы Флурохлоридона с концентрацией 0,01; 0,02; 0,05; 0,1 мкг/см³, которые могут храниться в холодильнике не более 30 суток.

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа вводят 1 мм³ рабочего раствора Флурохлоридона с концентрацией 0,01; 0,02; 0,05; 0,1 мкг/см³. Проводят не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Флурохлоридона в растворе в мкг/см³ (рис. 1 - не приводится).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 1743.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 26950-89 "Почвы. Отбор проб", ГОСТ 22391 "Подсолнечник", ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 1129-93 "Масло подсолнечное. ТУ" и ГОСТ 5471-83 "Масла растительные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы почвы хранят в холодильнике в полиэтиленовых пакетах при температуре 0 - 4 °C в течение суток. Для длительного хранения пробы замораживают и хранят в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 1 года. Допускается высушивание почвы при комнатной температуре в затемненном месте до воздушно-сухой влажности и последующее хранение в бумажных или тканевых мешочках в сухом, хорошо проветриваемом шкафу не более 6 месяцев.

Семена подсолнечника, подсушенные до стандартной влажности, хранят в тканевых мешочках, в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6-ти месяцев. Влажные семена замораживают и хранят в морозильной камере при -14 °C до 2-х лет. Пробы масла подсолнечника хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 10 суток.

Навеску почвы 10 г помещают в центрифужные банки объемом 250 см³, смачивают 5 см³ дистиллированной воды, заливают 50 см³ ацетонитрила и встряхивают в течение 30 мин. По окончании встряхивания пробу центрифугируют 15 минут при скорости 4000 об./мин. Фильтруют экстракт в концентратор емкостью 250 см³ через воронку с бумажным фильтром. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя каждый раз по 50 см³ ацетонитрила и встряхивая смесь в течение 15 мин. Экстракты объединяют в концентраторе. Растворитель выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 см³ гексана и наносят на колонку с Флоризилом, подготовленную, как указано в разделе 7.3. Промывают колонку 15 см³ гексана, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 10 см³ смеси гексан:ацетон - 4:1, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 10 см³ смеси гексан:ацетон - 1:1, собирая элюат в концентратор емкостью 100 см³. Содержимое концентратора выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 10 см³ ацетона и вводят в хроматограф 1 мм³.

9.2.1. Экстракция и предварительная очистка. Навеску семян подсолнечника 10 г помещают в полипропиленовую банку объемом 250 см³, смачивают 10 см³ дистиллированной воды, заливают 50 см³ ацетонитрила и встряхивают в течение 30 мин. По окончании встряхивания пробу центрифугируют 15 мин. при скорости 4000 об./мин. Фильтруют экстракт в концентратор емкостью 250 см³ через воронку с бумажным фильтром. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя каждый раз по 50 см³ ацетонитрила и встряхивая смесь в течение 15 мин.

Экстракты отфильтровывают через бумажный фильтр в делительную воронку емкостью 250 см³. К объединенному экстракту добавляют 30 см³ гексана и встряхивают содержимое делительной воронки. После разделения слоев нижний слой сливают в стаканчик, а гексан отбрасывают. Экстракт из стаканчика возвращают в делительную воронку и промывают тем же объемом гексана еще раз.

Нижний слой сливают в концентратор емкостью 250 см³. Растворитель выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C досуха (Выпаривание проводить осторожно, так как возможно вспенивание ацетонитрила!).

Сухой остаток в концентраторе разводят в 5 см³ гексана и очищают пробу на колонке с Флоризилом (см. раздел 9.1.2), а затем на патроне Диапак C16.

Сухой остаток после очистки на колонке с Флоризилом в концентраторе разводят в 1 см³ ацетона, добавляют 9 см³ дистиллированной воды, перемешивают содержимое, обмывая стенки концентратора, и наносят на патрон, подготовленный, как указано в разделе 7.1. Промывают патрон 20 см³ дистиллированной воды, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 15 см³ смеси ацетонитрил:вода - 1:1, собирая элюент в концентратор, и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C досуха.

Сухой остаток разводят в 10 см³ гексана и вводят в хроматограф 1 мм³ пробы.

9.3.1. Экстракция и предварительная очистка. Навеску масла 5 г помещают в стеклянный стаканчик емкостью 100 см³ и разводят в 50 см³ гексана. Содержимое стаканчика переносят в делительную воронку емкостью 250 см³. Добавляют в воронку 50 см³ ацетонитрила и встряхивают 2 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в коническую колбу, а верхний слой оставляют в делительной воронке, приливают туда 50 см³ ацетонитрила и встряхивают 2 мин. Ацетонитрильный экстракт сливают в ту же колбу. Экстракцию повторяют еще раз тем же объемом новой порции ацетонитрила.

Объединенный ацетонитрильный экстракт переносят в чистую сухую делительную воронку, добавляют туда 20 см³ гексана и промывают ацетонитрил, встряхивая воронку 1 - 2 мин. После разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в стаканчик, а гексан отбрасывают. Ацетонитрильный экстракт возвращают в делительную воронку и промывают еще раз 20 см³ гексана. После разделения фаз ацетонитрил сливают в концентратор емкостью 250 см³ и выпаривают его при температуре не выше 35 °C досуха.

Пробу в концентраторе разводят в 30 см³ гексана, переносят в делительную воронку. Добавляют туда 30 см³ ацетонитрила и проводят переэкстракцию Флурохлоридона в ацетонитрил, встряхивая воронку в течение 2 мин. После разделения фаз нижний слой ацетонитрила сливают в концентратор. Повторяют переэкстракцию еще два раза тем же объемом ацетонитрила. Объединенный экстракт выпаривают при температуре не выше 35 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторе разводят в 5 см³ гексана и очищают пробу на колонке с Флоризилом (см. раздел 9.1.2), а затем на патроне Диапак C16 (см. раздел 9.2.2).

Сухой остаток разводят в 5 см³ гексана и вводят в хроматограф 1 мм³ пробы.

Хроматограф "Кристалл 2000м" с детектором постоянной скорости рекомбинации ионов ⁶³Ni с пределом детектирования по Линдану не выше 4 x 10^-14 или другой с аналогичными характеристиками.

Капиллярная кварцевая колонка DB-1701 (14% цианопропилфенил - 86% метилсиликон), длина 15 м, внутренний диаметр 0,32 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура термостата колонки программированная: начальная температура - 170 °C, выдержка - 4 мин.; нагрев колонки по 10 °C/мин., до 220 °C; выдержка 5 мин.

Продувка детектора после анализа азотом - 65 см³/мин. в течение 3 мин. Нагрев колонки до 280 °C.

Температура испарителя - 250 °C, детектора - 340 °C.

Регулятор расхода гелия - РРГ-11; режим - Split less.

Газ 1 - гелий, линейная скорость - 23 см/сек., давление на входе - 32,11 кПа.

Газ 2 - гелий (продувка испарителя), расход - 1,0 см³/мин.; сброс 1:50.

Газ 3 - азот (поддув в детектор), расход во время анализа - 45 см³/мин.

Абсолютное время удерживания Флурохлоридона - 11 мин. 2 сек. - 11 мин. 9 сек.

Минимально детектируемое количество Флурохлоридона в анализируемом объеме - 0,01 нг.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 0,01 - 0,2 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией Флурохлоридона 0,2 мкг/см³ соответственно, разбавляют.

Количественное определение Флурохлоридона проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов Флурохлоридона с концентрацией 0,01 - 0,2 мкг/см³.

Для определения содержания Флурохлоридона в пробах методом ГЖХ используют следующую формулу:

X - содержание Флурохлоридона в пробе, мг/кг;

Sст - площадь пика стандарта, мВ;

Sпр - площадь пика образца, мВ;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/см³;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см³;

m - масса анализируемого образца, г;

P - содержание Флурохлоридона в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r - значение предела повторяемости (табл. 1), при этом .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

мг/кг при вероятности P = 0,95, где

- среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента ниже нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

--------------------------------

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки должна удовлетворять условию:

- характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой), мг/кг, при этом:

- граница абсолютной погрешности, мг/кг;

- граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

Результат контроля процедуры (К_к) рассчитывают по формуле:

, , - среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце и концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (К_к) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R - предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном определяемых концентраций, таблица 1), %.