"МУК 4.1.2162-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств 2,4-Д в масле кукурузы методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2007)

1. Методические указания подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в масле кукурузы массовой концентрации 2,4-Д в диапазоне 0,005 - 0,05 мг/кг.

Фирма-производитель: ЗАО "ФМРус", ООО "Сибагрохим".

Торговое название: Аврорекс, Элант.

Название действующего вещества по ИСО: 2,4-Д.

Название по ИЮПАК: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота.

Структурная формула (не приводится).

2-й класс опасности.

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,0001 мг/кг/сутки;

МДУ в сельскохозяйственной продукции (мг/кг): все продукты - нд (предел обнаружения - 0,005).

Область применения

2,4-Д - селективный, системный гербицид, эффективно подавляющий рост и развитие большинства двудольных широколистных сорных растений. У чувствительных к препарату растений происходит угнетение процессов фотосинтеза, стимуляция или угнетение дыхания, нарушение метаболизма азотосодержащих соединений, разобщение процессов окисления и фосфорилирования, снижение синтеза макроэргических фосфорных соединений и другие нарушения. Устойчивые растения обладают большей способностью к детоксикации гербицида и регуляторными системами, обеспечивающими стабильность обменных реакций.

Зарегистрирован в России под торговым названием Элант, КЭ (этилгексиловый эфир, 564 г кислоты/л) в качестве гербицида для подавления однолетних двудольных сорных растений в посевах кукурузы 0,8 - 1,2 л/га, а также Агрорекс, КЭ (этилгексиловый эфир 2,4-Д + Карфентразон-этил, 500 + 21 г/л соответственно).

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на определении 2,4-Д методом ГЖХ с использованием детектора по захвату электронов после извлечения ее из масла кукурузы 5%-ным водным раствором гидрокарбоната натрия, переэкстракции в эфир с последующим бутилированием и очисткой на колонке с Флоризилом.

Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001 или аналогичные.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г, ГОСТ 19491-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Мерные цилиндры на 10, 25 и 50 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц на 10 куб. мм, ТУ 2.833.106.

Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Ацетон, х.ч., ТУ 6-09-3513-86.

н-Бутанол, х.ч., ГОСТ 6006-78, свежеперегнанный.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Гелий очищенный марки "А", ТУ 51-940-80.

2,4-Д, аналитический стандарт с содержанием 99,3% д.в., ГСО 7648-99.

Диэтиловый эфир, х.ч., ГОСТ 6262-79.

Кислота серная концентрированная, ч., ГОСТ 4204-77.

Натрия гидрокарбонат, х.ч., ГОСТ 4201-89.

Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Стандартный раствор 2,4-Д в этаноле - 1 мг/мл (хранить в холодильнике, срок годности 120 суток).

Флоризил для колоночной хроматографии с размером частиц 60 - 80 меш, фирма "Мерк".

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Ванна ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Виалы с тефлоновыми прокладками, Aldrich, cat. N Z27,702-9.

Воронки химические для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi или ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, с водяной баней.

Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 куб. см, КПШ-100, КПШ-250, ГОСТ 10394-72.

Концентраторы грушевидные (конические) 100 и 250 куб. см, ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая ИР-1, 100% метилсиликон, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирмы Хьюлетт Паккард.

Колонки хроматографические стеклянные или пластиковые, длина 150 - 250 мм, диаметр 15 мм.

Нагревательный блок для виал, Dri-Block DB-3, Tecam.

Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neo Laboport.

Полипропиленовые банки емкостью 250 куб. см.

Стаканы стеклянные на 100 и 500 куб. см, ГОСТ 6236-72.

Установка для перегонки растворителей.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 15 см, диаметр 1,5 см) помещают пробочку из стекловаты и заполняют колонку Флоризилом на высоту 10 см. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 см. Перед нанесением пробы колонку промывают 15 куб. см ацетона, высушивают, и 15 куб. см гексана. Колонка готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения 2,4-Д на колонке. На заранее подготовленную, как описано в пункте 7.1, колонку наносят 2 куб. см стандартного раствора бутилового эфира 2,4-Д в гексане с концентрацией 0,1 мкг/куб. см. Затем последовательно наносят на колонку 10 куб. см гексана и 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 10:1, элюаты отбрасывают.

2,4-Д элюируют с колонки последовательно 3 - 4-мя порциями объемом 5 куб. см каждая смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 25 - 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 2 куб. см гексана и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смыва бутилового эфира 2,4-Д с колонки и необходимый объем элюата.

К сухому остатку в виале добавляют 1 куб. см 2%-ного раствора концентрированной серной кислоты в бутаноле. Плотно закрывают виалу крышкой и помещают в блок для виал, нагретый до 100 °С. Бутилирование проводят в течение 30 минут. Далее виалу охлаждают до комнатной температуры и добавляют в виалу 5 куб. см гексана и 20 - 25 куб. см дистиллированной воды. Смесь интенсивно встряхивают и после разделения фаз верхний гексановый слой, содержащий бутиловый эфир 2,4-Д, используют для анализа.

7.4.1. Приготовление раствора для бутилирования

Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

В мерную колбу объемом 100 куб. см наливают около 60 куб. см н-бутанола и осторожно приливают 2 куб. см концентрированной серной кислоты. Перемешивают раствор и доводят объем до метки бутанолом. Бутилирующую смесь хранят под тягой в течение одного месяца. Перед приготовлением раствора н-бутанол перегоняют.

7.4.2. Приготовление 4 н водного раствора серной кислоты

Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

В мерную колбу объемом 1 куб. дм наливают около 500 куб. см и осторожно приливают 112 куб. см концентрированной серной кислоты к дистиллированной воде. Осторожно перемешивают раствор, добавляют воды, но не до метки. Когда раствор остынет, его доводят водой до метки.

7.4.3. Приготовление 5%-ного водного раствора гидрокарбоната натрия

В стакан на 500 куб. см помещают 50 гидрокарбоната натрия. Доливают около 200 куб. см воды и растворяют соль на ультразвуковой ванне, помешивая стеклянной палочкой. Раствор переливают в мерную колбу объемом 1 куб. дм. При необходимости процедуру повторяют. Раствор в колбе доводят водой до метки.

7.4.4. Приготовление стандартных растворов 2,4-Д

100 мг 2,4-Д (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют навеску в этаноле и доводят объем до метки этанолом (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/куб. см). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Методом последовательного разбавления исходного раствора N 1 этанолом готовят стандартный раствор N 2 с концентрацией 5,0 мкг/куб. см, который может храниться в холодильнике не более 30 суток.

7.4.5. Приготовление стандартных растворов бутилового эфира 2,4-Д

Стандартные растворы бутилового эфира 2,4-Д используют для построения градуировочного графика, а также для проверки его поведения на колонке с Флоризилом. Отбирают 1 куб. см стандартного раствора N 2 в виалу, удаляют растворитель током теплого воздуха и проводят бутилирование, как указано в разделе 7.3. Получают стандартный раствор N 3 бутилового эфира 2,4-Д с концентрацией 1,0 мкг/куб. см по кислоте. Из него последовательным разбавлением в гексане готовят рабочие растворы с концентрациями: 0,1; 0,05; 0,02; 0,01 мкг/куб. см.

Для построения градуировочного графика в инжектор хроматографа последовательно вводят по 1 куб. мм каждого рабочего раствора бутилового эфира 2,4-Д с концентрацией по кислоте 0,1; 0,05; 0,02; 0,01 мкг/куб. см. Проводят не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение площади хроматографического пика для каждой концентрации.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации 2,4-Д в растворе в мкг/куб. см (рисунок 1 - не приводится).

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 8808-91 "Масло кукурузное, ТУ".

Пробы масла кукурузы хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С не более 30 дней.

Для исследовательских целей допускается получение масла в лаборатории из проб зерна методом экстракции горячим растворителем при температуре не выше 40 °С.

Навеску масла 10 г переносят в полипропиленовую банку объемом 250 куб. см и растворяют в 30 куб. см гексана, добавляют к раствору 50 куб. см 5%-ного водного раствора гидрокарбоната натрия и помещают емкость в ультразвуковую ванну на 10 минут. По истечении времени смесь переносят в делительную воронку и после полного разделения слоев нижний водный слой собирают в концентратор объемом 250 куб. см, а верхний гексановый - сливают в ту же полипропиленовую банку. Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 50 куб. см 5% гидрокарбоната натрия, выдерживая в ультразвуковой ванне каждый раз в течение 5 минут. Водные фракции объединяют.

Объединенную водную фракцию переносят в чистую делительную воронку, добавляют 25 куб. см гексана и интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой собирают в чистый концентратор, а гексан отбрасывают. Повторяют процедуру еще <...> раза тем же объемом гексана.

Далее водную фракцию переносят в ту же делительную воронку, подкисляют ее 4 н раствором серной кислоты до pH = 1 (примерно 30 куб. см). Воронку выдерживают до полного прекращения выделения углекислого газа, периодически осторожно встряхивая.

После этого добавляют в воронку 30 куб. см эфира и интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой собирают в тот же концентратор, а верхний эфирный - переносят в чистый концентратор емкостью 250 куб. см, пропуская через воронку с безводным сульфатом натрия. Водную фракцию возвращают в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще дважды, используя для этого каждый раз 30 куб. см эфира. Эфирные экстракты объединяют в концентраторе, а водную фракцию отбрасывают.

Объединенный эфирный экстракт выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °С досуха. Сухой остаток переносят тремя порциями по 3 куб. см диэтилового эфира в виалу и высушивают током теплого воздуха. Проводят бутилирование, как указано в пункте 7.3, и последующую очистку на колонке с Флоризилом, пункт 9.1.2.

9.1.2. Очистка на колонке с Флоризилом

Из верхнего гексанового слоя в виале, полученного по пункту 7.3, отбирают аликвоту 2 куб. см и наносят на подготовленную, как описано в разделе 7.1, колонку. Последовательно промывают колонку 10 куб. см гексана и 5 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 10:1, смывы отбрасывают. Элюируют бутиловый эфир 2,4-Д 10 куб. см смеси гексана с ацетоном в соотношении 2:1, элюат выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 2 куб. см гексана и 1 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-1, 100% метилсиликон, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирмы Хьюлетт Паккард.

Температура детектора - 320 °С, испарителя - 260 °С, программированный нагрев колонки со 180 °С (выдержка 2 минуты) по 5 град./мин. до 220 °С (выдержка 2 минуты).

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, режим нормальный, скорость 25 см/с, давление 116,9 кПа.

Газ 2 (гелий) - 10 куб. см/мин.: расход 0,5 куб. см/мин., сброс 1:20.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 45 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания 2,4-Д бутиловый эфир - 6 мин. 36 сек. +/- 2%.

Линейность детектирования сохраняется в пределах - 0,01 - 0,1 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 2,4-Д 0,1 мкг/мл, соответственно разбавляют.

Количественное определение 2,4-Д проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов бутилового эфира 2,4-Д с концентрацией по кислоте 0,01 - 0,1 мкг/куб. см.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание 2,4-Д рассчитывают по формуле:

где:

Х - содержание 2,4-Д в пробе, мг/кг;

Sст - высота (площадь) пика стандарта, мВ;

Sпр - высота (площадь) пика образца, мВ;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

D - фактор разбавления, учитывающий взятие аликвоты (по методике = 2,5);

m - масса анализируемого образца, г;

Р - содержание 2,4-Д в аналитическом стандарте, %.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,005 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

ФГОУ ВПО Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".