"МУК 4.1.2403-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств этабоксама в воде, почве, ботве и клубнях картофеля, ягодах винограда и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 17.07.2008)

1. Разработаны сотрудниками Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения (протокол N 2 от 03.07.2008).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия населения, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17 июля 2008 г.

4. Введены впервые.

Торговое наименование: LGC-30473.

Фирма производитель: Саммит Агро Европа, Лимитед.

Действующее вещество: Этабоксам.

Структурная формула (не приводится).

(RS)-(альфа-циано-2-тиэнил)-4-этил-2-(этиламино)-1,3-тиазол-5-карбоксамид (IUPAC).

N-(циано-2-тиенилметил)-4-этил-2-(этиламино)-5-тиазолкарбоксамид (CAS).

Мол. масса: 320,4.

Растворимость в воде 4,8 мг/куб. дм (20 °С), 5,2 мг/куб. дм (25 °С, рН 7).

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм, 20 °С): н-гептан - 0,000392; ксилол - 0,136; 1,2-дихлорэтан - 2,90; метанол - 17,6; н-октанол - 0,374; ацетон - 39,7; этилацетат - 10,6. Стабилен в водных растворах при рН 4 - 9.

Область применения: профилактический, лечебный, трансламинарный и системный фунгицид, применяется для контроля оомицетов, таких как пушистая плесень на винограде и картофеле с нормой расхода 125 - 250 г/га. Ингибитор роста и спороношения грибов.

Гигиенические нормативы для этабоксама в России не установлены.

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств этабоксама в воде в диапазоне концентраций 0,002 - 0,02 мг/кг, почве - 0,01 - 0,1 мг/кг, ботве картофеля - 0,02 - 0,2 мг/кг, клубнях картофеля - 0,01 - 0,1 мг/кг, ягодах винограда - 0,004 - 0,04 мг/кг, виноградном соке - 0,004 - 0,04 мг/кг.

Методика основана на определении этабоксама методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

Ацетон, осч, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ".

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Диэтиловый эфир, ч., ОСТ 84-2006-88.

Железо (II) сернокислое, х.ч., ГОСТ 4148-78.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, имп. (Ferak, Германия) или х.ч., ГОСТ 6552-80; 2М и 0,025М водные растворы.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - 0,025М ортофосфорная кислота (25:75, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 - 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - диэтиловый эфир (50:50, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - диэтиловый эфир (25:75, по объему).

Этабоксам, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98%.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка Symmetry C-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Предколонка Waters Symmetry C-18.

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001, или аналогичные.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

рН-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Насос водоструйный, МРТУ 42861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

Отбор проб почвы производится в соответствии с ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; воды - ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб"; картофеля - ГОСТ 7194-81 "Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества"; винограда - ГОСТ 25896-83 "Виноград свежий столовый. Технические условия". Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм. Пробы ботвы и клубней картофеля, ягод винограда хранят до анализа в морозильной камере при температуре не выше -18 °С в течение месяца. Перед анализом их гомогенизируют. Пробы воды и виноградного сока хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение недели.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry C-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 куб. дм смешивают 500 куб. см ацетона с 500 куб. см дистиллированной воды.

Для получения 25%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 куб. дм смешивают 250 куб. см ацетона с 750 куб. см дистиллированной воды.

Для приготовления насыщенного раствора хлорида натрия 380 г NaCl растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды, полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр "красная лента".

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,025М раствора ортофосфорной кислоты в соотношении 25:75 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 куб. см смешивают 500 куб. см н-гексана и 500 куб. см диэтилового эфира.

Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 куб. см смешивают 250 куб. см н-гексана и 750 куб. см диэтилового эфира.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску этабоксама (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы (смесь ацетонитрил - 0,025М ортофосфорная кислота (25:75, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты открывания этабоксама в воде, почве, ботве и клубнях картофеля, ягодах винограда и виноградном соке используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/куб. см готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация этабоксама в растворе) в хроматограф вводят по 50 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации этабоксама в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (50:50, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 куб. см элюента N 2 и 30 куб. см элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения этабоксама на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 0,1 куб. см стандартного раствора этабоксама с концентрацией 10 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 куб. см элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 куб. см элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 30 куб. см элюента N 1, которые отбрасывают, затем 100 куб. см элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, выпаривают, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание этабоксама (п. 2.6.5).

Фракции, содержащие этабоксам, объединяют, выпаривают досуха, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют (п. 2.6.5). Рассчитывают содержание этабоксама в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания этабоксама и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6.1. Извлечение этабоксама из проб воды и виноградного сока

Перед проведением анализа пробу виноградного сока объемом 50 куб. см доводят до объема 100 куб. см дистиллированной водой. Пробу воды или разбавленного сока объемом 100 куб. см помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют этабоксам диэтиловым эфиром трижды порциями по 50 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний эфирный слой <*>. Объединенный экстракт промывают в делительной воронке 0,025М раствором NaOH дважды порциями по 25 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний эфирный слой. Экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 куб. см диэтилового эфира. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. При необходимости проводят дополнительную очистку экстракта на колонке с силикагелем по пункту 2.6.4.

--------------------------------

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения (на стадии переэкстракции из водного раствора в диэтиловый эфир) в делительную воронку можно добавить насыщенный раствор хлорида натрия (15 - 20 куб. см).

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.2. Извлечение этабоксама из проб ягод винограда

Гомогенизированные пробы ягод винограда массой 50 г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют этабоксам 50 куб. см 75%-ного водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу. Экстракцию проводят еще дважды. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона (объем 50 - 60 куб. см). Объем экстракта доводят до 100 куб. см добавлением дистиллированной воды. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Раствор помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см и экстрагируют этабоксам диэтиловым эфиром трижды порциями по 50 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний эфирный слой <*>. Объединенный экстракт промывают в делительной воронке 0,025М раствором NaOH дважды порциями по 25 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний эфирный слой. Экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 куб. см диэтилового эфира. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.3. Извлечение этабоксама из проб почвы, ботвы и клубней картофеля

Гомогенизированные пробы клубней картофеля, воздушно-сухой почвы массой 20 г или ботвы картофеля массой 10 г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют этабоксам 50 куб. см 50%-ного водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу. Экстракцию проводят еще дважды. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона (объем 70 - 75 куб. см). Объем экстракта доводят до 100 куб. см добавлением дистиллированной воды. Раствор помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см и экстрагируют этабоксам диэтиловым эфиром трижды порциями по 50 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний эфирный слой <*>. Объединенный экстракт промывают в делительной воронке 0,025М раствором NaOH дважды порциями по 25 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний эфирный слой. Экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 куб. см диэтилового эфира. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

2.6.4. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный по п. п. 2.6.1 - 3, количественно переносят двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (50:50, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 30 куб. см элюента N 1, который отбрасывают. Этабоксам элюируют 75 куб. см элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 куб. см. Раствор выпаривают досуха в вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка Symmetry C18 (250 х 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA), или аналогичная.

Температура колонки 30 +/- 1 °С.

Предколонка Symmetry C18 для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,025М ортофосфорная кислота в объемном соотношении 25:75.

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Рабочая длина волны 235 нм.

Объем вводимой пробы 50 куб. мм.

Время удерживания этабоксама 11,6 +/- 0,2 мин.

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,00 мкг/куб. см.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной градуировки, содержание этабоксама в образцах воды, почвы, ботвы и клубнях картофеля, ягодах винограда и виноградном соке (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств этабоксама в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор этабоксама 2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6.2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.