"МУК 4.1.2204-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Обнаружение, идентификация и количественное определение охратоксина A в продовольственном сырье и пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 20.05.2007)

1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (академик РАМН, профессор В.А. Тутельян, д.х.н. К.И. Эллер, к.м.н. И.В. Аксенов).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 мая 2007 г. и введены в действие с 1 августа 2007 г.

4. Введены впервые.

Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определения охратоксина A в продовольственном сырье и пищевых продуктах и предназначены для проведения лабораторных исследований учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, в организациях, осуществляющих контроль безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.

Охратоксин A - микотоксин, продуцируемый микроскопическими грибами родов Aspergillus и Penicillium. Основными продуцентами охратоксина A являются A. ochraceus и P. verrucosum.

Охратоксин A (; молекулярная масса 403,8), представляющий собой по химической структуре 5-хлоризокумарин, связанный пептидной связью с L-фенилаланином, хорошо растворим в полярных органических растворителях и водном растворе гидрокарбоната натрия, малорастворим в воде. При фотометрировании раствора охратоксина A в толуол-уксусной кислоте (99:1) максимум поглощения наблюдается при длине волны, равной 333 нм, при этом относительный молярный коэффициент поглощения равен 544 м2/моль.

В экспериментах in vivo показано нефротоксическое, канцерогенное, тератогенное, эмбриотоксическое, нейротоксическое и иммунотоксическое действие охратоксина A. Международное агентство по изучению рака классифицирует охратоксин A как соединение, потенциально канцерогенное для человека (Группа 2B). Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по пищевым добавкам и контаминантам установлена величина условно переносимого недельного поступления охратоксина A с пищей - 100 нг/кг массы тела.

Охратоксин A выявляется повсеместно в качестве природного загрязнителя продовольственного и кормового зерна, кофе и какао-бобов, винограда и специй.

Метод включает следующие этапы:

- экстракция охратоксина A из пробы смесью ацетонитрил-вода (60:40% об.);

- очистка экстракта на иммуноаффинной колонке;

- определение охратоксина A с помощью ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием при длине волны возбуждения 333 нм и длине волны эмиссии 466 нм.

Диапазон определяемых концентраций: 0,0001 - 0,016 мг/кг.

Предел количественного определения: 0,0005 мг/кг.

Для приготовления стандартного раствора хранения (концентрация охратоксина A - 10 нг/мкл) навеску кристаллического охратоксина A массой 5 мг помещают в мерную колбу объемом 500 см3, приливают 50 см3 смеси толуол - уксусная кислота (98:2% об.), тщательно перемешивают до полного растворения вещества и доводят той же смесью растворителей до метки. Для установления точной концентрации раствора хранения измеряют его оптическую плотность при длине волны 333 нм . Концентрацию раствора вычисляют по формуле:

Далее 5 см3 стандартного раствора охратоксина A с концентрацией 10 нг/мкл разбавляют смесью толуол - уксусная кислота (98:2% об.) до объема 100 см3, получая рабочий раствор с концентрацией 0,5 нг/мкл.

Для приготовления рабочих растворов охратоксина A с концентрацией 0,005; 0,05 и 0,1 нг/мкл отбирают соответственно 50, 500 и 1000 мкл раствора с концентрацией 0,5 нг/мкл, упаривают досуха и растворяют в 5 см3 подвижной фазы.

Раствор хранения охратоксина A содержат в стеклянной посуде с притертой пробкой в темном прохладном месте (при температуре около 0 °C) до одного года и используют для приготовления рабочих стандартных растворов. Рабочие стандартные растворы хранят в вайлах из темного стекла в темном прохладном месте (при температуре около 0 °C) в течение 1 месяца.

Перед использованием рабочих стандартных растворов их следует довести до комнатной температуры и только после этого следует открывать пробки.

Навеску натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного массой 1,15 г, навеску натрия однозамещенного 2-водного массой 0,124 г и навеску натрия хлорида массой 1,74 г переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, добавляют 10 - 20 см3 дистиллированной воды. Перемешивают и доводят объем раствора в колбе до метки. Срок хранения - 1 месяц в холодильнике.

Толуол-уксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят толуолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил - вода (60:40% об.).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят водой до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Ацетонитрил - вода (60:40% об.; pH = 3,0).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 600 см3 ацетонитрила и, перемешивая, доводят бидистиллированной водой до метки. Внесением фосфорной кислоты подводят pH смеси до величины, равной 3,0. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Метанол-уксусная кислота (98:2% об.).

В мерную колбу на 1000 см3 вносят 20 см3 уксусной кислоты и, перемешивая, доводят метанолом до метки. Срок хранения - 1 месяц в темном прохладном месте.

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией:

- "Зерно. Правила приемки и методы отбора проб" ГОСТ 13586.3-83;

- "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб" ГОСТ 26312.1-84;

- "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб" ГОСТ 27668-88;

- "Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию" ГОСТ 8756.0-70.

Пробы для анализа, представительные по концентрации микотоксинов для всей партии, следует отбирать из предварительно гомогенизированного среднего (исходного) образца массой 2 кг.

Отобранные пробы измельчают в течение 1 - 2 мин в лабораторной мельнице. При этом используют две параллельные пробы.

6.2.1. Экстракция

Навеску 25 г измельченной пробы помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 см3, добавляют 100 см3 смеси ацетонитрил-вода (60:40% об.). Экстрагируют на аппарате для встряхивания проб в течение 30 мин. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента". Отбирают 10 см3 фильтрата и добавляют 90 см3 фосфатного буферного раствора, pH = 7,4.

6.2.2. Очистка экстракта

На иммуноаффинную колонку наносят 100 мл полученной смеси со скоростью 1 - 2 капли в секунду, промывают 20 см3 фосфатного буферного раствора, pH = 7,4. Охратоксин A элюируют 3 см3 смеси метанол-уксусная кислота (98:2% об.).

Элюат упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 400 мкл подвижной фазы (раствор А).

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза - ацетонитрил - вода (60:40% об.; pH = 3,0); скорость подвижной фазы - 1,5 см3/мин.

Флуориметрический детектор устанавливают на длину волны возбуждающего излучения 333 нм, на линии эмиссии устанавливают эмиссионный фильтр с полосой пропускания 466 нм.

Для анализа проб в инжектор хроматографа вводят с помощью микрошприца 50 мкл тестового образца (раствора А). При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с охратоксином A, рассчитывают массу охратоксина A во вколе с помощью градуировочного графика.

Для построения градуировочного графика проводят хроматографический анализ серии рабочих растворов стандартов. В инжектор с помощью микрошприца вводят 50 мкл рабочего раствора стандарта с концентрацией 0,005 нг/мкл, что соответствует 0,25 нг охратоксина A. Подобное делается для других стандартных растворов с концентрациями 0,05 и 0,10 нг/мкл, что в свою очередь соответствует 2,5 и 5,0 нг охратоксина A во вколе. В указанных условиях время удерживания находится для охратоксина A в диапазоне от 4 до 5 мин. На основании полученных данных строят градуировочный график (зависимость площади хроматографического пика от массы охратоксина A во вколе).

Расчет концентрации охратоксина A в пробе проводится по формуле:

- концентрация охратоксина A в пробе, мг/кг;

M - масса навески для анализа, г (25,0);

m - масса охратоксина A, соответствующая введенному в хроматограф объему раствора А, нг;

- объем раствора для экстракции, см3 (100);

- объем экстракта, нанесенный на ИАК, см3 (10);

- общий объем раствора А, см3 (0,4);

- объем раствора А, введенный в хроматограф, см3 (0,05).

При высоких уровнях загрязнения охратоксином A пробы необходимо увеличить объем раствора А с внесением соответствующих изменений в формулу.

За окончательный результат испытаний принимается среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений:

Результат анализа представляют в виде (при вероятности P = 0,95):

- граница абсолютной погрешности:

- граница относительной погрешности методики (показатель точности), % (табл. 1).

Если содержание охратоксина A в пробе менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание охратоксина A в пробе зерна менее 0,0001 мг/кг" <*>

--------------------------------

<*> 0,0001 мг/кг - предел обнаружения.

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (r) (табл. 1):

Если расхождение между параллельными определениями не превышает допустимого:

то среднее арифметическое принимают за результат анализа.

При превышении норматива R следует повторить измерения, используя резервные пробы.

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья и пищевых продуктов. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют такое количество раствора стандарта охратоксина A, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 - 100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

Обе пробы анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результаты анализа исходной пробы и пробы с добавкой . Определение проводят в одинаковых условиях, а именно: анализ проводит одни аналитик, с использованием одного набора мерной посуды, реактивов, растворов и т.д.

Алгоритм проведения оперативного контроля погрешности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольного определения, равного разности между результатом контрольного измерения пробы с добавкой , пробы без добавки и величиной добавки с нормативом оперативного контроля (K). Решение об удовлетворительной погрешности принимается при выполнении следующего условия (при P = 0,95):

Норматив оперативного контроля погрешности рассчитывают по формуле (P = 0,90):

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

При выполнении анализов необходимо соблюдать правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005, ГОСТ 12.2.007.0 и ГОСТ 4658. Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционными системами по ГОСТ 12.4.021.

К выполнению анализа охратоксина A в зерне и зернопродуктах допускаются лица со специальным высшим образованием или средним специальным образованием, владеющие техникой ВЭЖХ-анализа, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие опыт работы в химической лаборатории.

Температура окружающего воздуха от 15 до 25 °C.

Относительная влажность воздуха не более 80% при 25 °C.

Атмосферное давление 730 - 760 мм рт. ст.

Напряжение электропитания: 210 - 220 В. Частота переменного тока: 45 - 50 ГЦ.