"МУК 4.1.2393-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств прохлораза в ботве и корнеплодах свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.07.2008)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 апреля 2008 г. N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 20 сентября 2008 г.

5. Введены впервые.

Действующее вещество: прохлораз.

Структурная формула (не приводится).

N-пропил-N-[2-(2,4,6-трихлорфенокси)этил]имидазол-1-карбоксамид (IUPAC).

N-пропил-N-[2-(2,4,6-трихлорфенокси)этил]-1H-имидазол-1-карбоксамид (CAS).

Мол. масса: 376,7.

Область применения: фунгицид с защитным и искореняющим действием, применяется против широкого диапазона заболеваний, повреждающих полевые культуры, фрукты и овощи.

Гигиенические нормативы для прохлораза в России: ОДК в почве - 0,3 мг/кг; ПДК в воде водоемов - 0,05 мг/куб. дм; ОБУВ в воздухе рабочей зоны - 0,1 мг/куб. м; МДУ для зерна хлебных злаков - 0,05 мг/кг. Для свеклы нормативы в РФ не установлены.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств прохлораза в ботве свеклы в диапазоне концентраций 0,02 - 0,2 мг/кг, в корнеплодах свеклы - 0,01 - 0,1 мг/кг.

Методика основана на определении прохлораза методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов органическим растворителем с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с флорисилом.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

Ацетон, ос.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Диэтиловый эфир, ч., ОСТ 84-2006-88.

Железо (II) сернокислое, х.ч., ГОСТ 4148-78.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Натрий углекислый кислый, ГОСТ 4201-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил-вода (65:35, по объему).

Стекловата.

Флорисил 150 - 250 мю m (Merck, Германия).

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-ацетон (90:10, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-ацетон (70:30, по объему).

Прохлораз, аналитический стандарт с содержанием д.в. 98%.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Колонка SunFire C-18 (250 x 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA) или аналогичная.

Предколонка SunFire C-18 (Waters, USA).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001 или аналогичные.

Гомогенизатор, МРТУ 42-1505-63.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

Насос водоструйный, МРТУ 42861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25 x 1) см.

Отбор образцов свеклы для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 1722-85 "Свекла столовая свежая, заготовляемая и поставляемая". Для длительного хранения аналитические пробы свеклы (ботва и корнеплоды) помещают в морозильную камеру с температурой -18 °C и хранят в закрытой полиэтиленовой таре.

Перед началом анализа колонку (SunFire C-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 500 куб. см ацетона с 500 куб. см дистиллированной воды.

Для получения 75%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 л смешивают 750 куб. см ацетона с 250 куб. см дистиллированной воды.

Для приготовления насыщенного раствора хлорида натрия 380 г NaCl растворяют при нагревании в 1 л дистиллированной воды, полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр "красная лента" и охлаждают до комнатной температуры.

Для приготовления 1 М раствора NaOH 40 г едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см, растворяют при перемешивании в 600 куб. см дистиллированной воды и доводят объем раствора до метки.

Для приготовления 0,025 М раствора NaOH 25 куб. см 1 М раствора едкого натра помещают в мерную колбу емкостью 1000 куб. см и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с бидистиллированной водой в соотношении 65:35 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 куб. см смешивают 900 куб. см н-гексана и 100 куб. см ацетона.

Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 куб. см смешивают 700 куб. см н-гексана и 300 куб. см ацетона.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску прохлораза (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы: смесь ацетонитрил-вода (65:35, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты определения прохлораза в ботве и корнеплодах свеклы используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,1 и 1,0 мкг/куб. см готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация прохлораза в растворе) в хроматограф вводят по 50 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций); измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации прохлораза в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г флорисила в 30 куб. см смеси гексан-ацетон (90:10, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 30 куб. см элюента N 2 и 30 куб. см элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 0,1 куб. см стандартного раствора прохлораза с концентрацией 10 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °C), остаток растворяют в 5 куб. см элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 куб. см элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 70 куб. см элюента N 1, который отбрасывают, затем 100 куб. см элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, выпаривают, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание прохлораза (п. 2.6.3).

Фракции, содержащие прохлораз, объединяют, выпаривают досуха, остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют (п. 2.6.3). Рассчитывают содержание прохлораза в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания прохлораза и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

Гомогенизированные пробы корнеплодов массой 20 г или ботвы массой 10 г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют прохлораз из корнеплодов и ботвы 50 куб. см 75%-ного водного ацетона на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу.

Экстракцию проводят еще дважды. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до полного удаления ацетона (объем 35 - 40 куб. см). Объем экстракта доводят до 70 куб. см добавлением насыщенного раствора хлорида натрия. К полученному раствору добавляют 10 мл 1 М раствора бикарбоната натрия. Раствор помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см и экстрагируют прохлораз диэтиловым эфиром трижды порциями по 50 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний эфирный слой <*>. Объединенный экстракт промывают в делительной воронке 0,025 М раствором NaOH дважды порциями по 25 куб. см, встряхивая смесь каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний эфирный слой. Экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 куб. см диэтилового эфира. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.2.

--------------------------------

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку на стадии переэкстракции из водного раствора в диэтиловый эфир насыщенный раствор хлорида натрия (15 - 20 куб. см).

Внимание! Отделение водного слоя следует производить только после полного расслоения жидкостей в делительной воронке.

Сухой остаток в колбе, полученный при выпаривании очищенных по п. 2.6.1 экстрактов, количественно переносят двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан-ацетон (90:10, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 70 куб. см элюента N 1, который отбрасывают. Прохлораз элюируют 60 куб. см элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 250 куб. см. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487), снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или другой с аналогичными характеристиками.

Колонка SunFire C18 (250 x 4,6) мм, зернение 5 мкм (Waters, USA) или Nova Pac Phenyl (150 x 3,9) мм, зернение 4 мкм (Waters, USA).

Температура колонки 30 +/- 1 °C.

Предколонка SunFire C18 (или Nova Pac Phenyl) для защиты аналитической колонки.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода в объемном соотношении 65:35 (или 45:55 при использовании колонки Nova Pac Phenyl).

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Рабочая длина волны 228 нм.

Объем вводимой пробы 50 куб. мм.

Время удерживания прохлораза 11,5 +/- 0,2 мин. (на колонке SunFire C18) или 11,4 +/- 0,2 мин. (на колонке Nova Pac Phenyl).

Линейный диапазон детектирования 0,1 - 2,00 мкг/куб. см.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание прохлораза в ботве и корнеплодах свеклы (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств прохлораза в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор прохлораза 2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг*, где * - 0,005 мг/кг - предел обнаружения).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.