"МУК 4.1.2548-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флумиоксазина в семенах и масле подсолнечника методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.09.2009)

1. Разработаны Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 июня 2009 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 сентября 2009 г.

4. Введены в действие с 1 декабря 2009 г.

5. Введены впервые.

Действующее вещество: флумиоксазин.

Название действующего вещества по номенклатуре ИЮПАК: N-(7-фтор-3,4-дигидро-3-оксо-4-проп-2-инил-2H-1,4-бензоксазин-6-ил)-циклогекс-1-ен-1,2-дикарбоксамид.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 354,3.

Химически чистое вещество: желтовато-коричневый порошок без запаха.

Температура плавления: 202 - 204 °С.

Гигиенические нормативы: МДУ для подсолнечника не установлен.

Гербицид для борьбы с однолетними двудольными и некоторыми однолетними злаковыми сорными растениями на посевах подсолнечника, сои, кукурузы и других.

2.1.1. Область применения и принцип метода. Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств флумиоксазина в семенах подсолнечника в диапазоне концентраций 0,05 - 0,5 мг/кг, в масле подсолнечника - 0,025 - 0,25 мг/кг.

Методика основана на определении флумиоксазина методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетонитрильной смесью с последующей очисткой жидкостной экстракцией и на концентрирующих патронах.

2.1.2. Метрологические характеристики. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

2.1.3. Избирательность метода. Избирательность метода определения флумиоксазина достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

Отбор проб семян подсолнечника производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Масло подсолнечника хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 мес.

2.5.2. Кондиционирование колонки. Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 - 0,2 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 ч.

Приготовление растворов

Для приготовления 0,005 М раствора ортофосфорной кислоты 0,5 г 98%-ной ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 куб. дм, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов

Точную навеску флумиоксазина (50 мг) помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см, растворяют в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см.) Градуировочные растворы с концентрациями 0,25; 0,5; 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - смесь ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота (55:45, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

При изучении полноты извлечения флумиоксазина используют ацетонитрильные растворы вещества.

Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация флумиоксазина в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации флумиоксазина в градуировочном растворе.

Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта

2.5.6.1. Кондиционирование патрона, заполненного гексадецилсиликагелем - Диапак С16 (0,4 г), осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 1 куб. см метанола и воды. Элюат отбрасывают.

2.5.6.2. Кондиционирование патрона для повторной очистки экстрактов семян и масла, заполненного силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 1 куб. см смеси гексана и этилацетата в соотношении 75:25.

2.6.1. Определение флумиоксазина в семенах подсолнечника. Навеску размолотых на лабораторной мельнице семян массой 10 г помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 10 куб. см воды и 40 куб. см ацетонитрила. Флумиоксазин экстрагируют на ультразвуковой бане в течение 10 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром "красная лента". Экстракцию повторяют и объединенный экстракт дважды промывают в делительной воронке 20 куб. см гексана. Раствор упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетонитрила. Водный остаток пропускают через концентрирующий патрон Диапак С16, откондиционированный по п. 2.5.6.1. Патрон промывают 4 куб. см воды. Фильтрат и промывку отбрасывают. Флумиоксазин элюируют 3 куб. см ацетона в чистую круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см. Элюат упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С), сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан - этилацетат (75:25), и полученный раствор количественно вносят в подготовленный концентрирующий патрон, заполненный силикагелем 60. Патрон промывают 2 куб. см смеси гексан - этилацетат (75:25). Фильтрат и промывку отбрасывают. Флумиоксазин элюируют 2 куб. см этилацетата. Полученный раствор упаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С), сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм образца вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение флумиоксазина в масле подсолнечника. Навеску масла (20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 250 куб. см, прибавляют 20 куб. см воды и 80 куб. см ацетонитрила и экстрагируют флумиоксазин на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Колбу помещают на 30 мин. в холодильник для более полного разделения слоев. Содержимое колбы осторожно переносят в делительную воронку, отделяют нижний слой масла и отбрасывают. Оставшийся в воронке водно-ацетонитрильный слой дважды промывают 20 куб. см гексана и упаривают на ротационном испарителе (40 °С) до полного удаления ацетонитрила. Водный остаток подвергают очистке на концентрирующих патронах так же, как это описано в п. 2.6.1. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм образца вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Условия хроматографирования. Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка - ACQUITY UPLC ВЕН С18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters). Температура колонки 30 +/- 1 °С. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 55:45. Скорость потока элюента: 0,2 куб. см/мин. Рабочая длина волны 290 нм. Объем вводимой пробы 10 куб. мм. Время удерживания флумиоксазина 3,9 +/- 0,1 мин.

Альтернативные условия хроматографирования: жидкостный хроматограф "Breeze" фирмы Waters с УФ-детектором и дегазатором. Рабочая длина волны 290 нм. Аналитическая колонка Spherisorb ODS2 (Waters) 150 х 2,1 мм, 3 мкм. Подвижная фаза ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 50:50. Скорость потока элюента 0,2 куб. см/мин. Дозируемый объем 20 куб. мм.

Содержание флумиоксазина в образцах семян и масла подсолнечника (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флумиоксазина 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,05 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения флумиоксазина в семенах подсолнечника.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.