"МУК 4.1.2476-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ипконазола в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 06.02.2009)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 февраля 2009 г.

4. Введены в действие с 29 апреля 2009 г.

5. Введены впервые.

Торговое наименование: Крусо МЭ.

Фирма-производитель: Кромптон Европа Лтд.

Действующее вещество: ипконазол.

Структурная формула (не приводится).

Область применения: фунгицид для борьбы с широким кругом болезней семян, эффективен против гельминтоспориозной пятнистости листьев и ржавчины. Рацематы I и II обладают одинаковой активностью. Механизм действия - ингибирование биосинтеза эргостерина.

Гигиенические нормативы для ипконазола в России не установлены.

2.1.1. Область применения и принцип метода. Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств ипконазола в воде водоемов в диапазоне концентраций 0,001 - 0,01 мг/кг, в почве - 0,05 - 1,0 мг/кг, в зерне хлебных злаков - 0,01 - 0,1 мг/кг и в соломе - 0,05 - 0,5 мг/кг.

Методика основана на определении ипконазола методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой на концентрирующих патронах.

2.1.2. Метрологические характеристики. При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

2.1.3. Избирательность метода. Избирательность метода определения ипконазола достигается условиями подготовки проб и хроматографического анализа.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб". Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторной мельнице.

2.5.2. Кондиционирование колонки. Перед началом анализа аналитические колонки кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,25 - 1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску ипконазола (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см.) Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - смесь ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота (55:45, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике в силанизированном или тефлоновом флаконе при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы используют в течение рабочего дня.

При изучении полноты извлечения ипконазола используют ацетонитрильные растворы вещества.

2.5.4. Построение градуировочного графика. Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация ипконазола в растворе) в хроматограф вводят по 10 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации ипконазола в градуировочном растворе.

2.5.5. Подготовка приборов и средств измерения. Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.5.6. Подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта.

2.5.6.1. Кондиционирование патрона, заполненного октадецилсиликагелем Bond Elut С18 (0,5 г), осуществляют, пропуская через патрон последовательно по 3 мл ацетонитрила и воды. Элюат отбрасывают.

2.5.6.2. Кондиционирование патрона для повторной очистки экстрактов зерна и соломы, заполненного силикагелем 60 (0,5 г), осуществляют пропусканием 3 мл гексана со скоростью 1 - 2 капли в секунду.

2.6.1. Определение ипконазола в пробах воды. Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 25 куб. см пропускают через кондиционированный концентрирующий патрон, заполненный октадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Ипконазол элюируют 5 куб. см ацетона. Элюат выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С и сухой остаток растворяют в 0,25 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ. 10 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.2. Определение ипконазола в пробах почвы. Образец предварительно просеянной через сито почвы массой 10 г помещают в коническую колбу емкостью 100 куб. см с притертой пробкой, добавляют 5 см воды и 35 куб. см ацетона. Колбу помещают в ультразвуковую баню и экстрагируют ипконазол в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера (фильтр "красная лента"), осадок на фильтре промывают 5 куб. см ацетона. Фильтрат упаривают на ротационном испарителе (40 °С) до водного остатка. Водный остаток пропускают через подготовленный по п. 2.5.6 патрон с октадецилсиликагелем. Фильтрат отбрасывают. Колбу ополаскивают дважды порциями по 3 мл ацетонитрила и смывы также пропускают через тот же патрон. Фильтрат отбрасывают. Ипконазол элюируют 5 куб. см ацетона. Элюат собирают, выпаривают досуха на ротационном испарителе (40 °С) и сухой остаток растворяют в 5 куб. см подвижной фазы. 10 куб. мм вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Определение ипконазола в пробах зерна и соломы зерновых колосовых культур. Навеску размолотого на лабораторной мельнице зерна массой 10 г или измельченной на ножевой мельнице соломы массой 5 г помещают в коническую колбу емкостью 100 куб. см. В колбу добавляют 10 куб. см воды и 40 куб. см ацетона и экстрагируют ипконазол на ультразвуковой бане в течение 15 мин. Суспензию фильтруют в вакууме через воронку Бюхнера с фильтром "красная лента". Экстракцию повторяют с 30 куб. см ацетона, выдерживая в ультразвуковой ванне в течение 15 мин., суспензию фильтруют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят до 10 куб. см дистиллированной водой. Полученный раствор переносят во фторопластовую пробирку и центрифугируют при 8 тыс. об./мин. в течение 10 мин. (или при наличии взвеси раствор дополнительно фильтруют через бумажный фильтр "красная лента", фильтр промывают 3 мл воды и фильтраты объединяют). Дальнейшую очистку проводят на патроне Диапак С18. В кондиционированный по п. 2.5.6 патрон вносят водный раствор после центрифугирования, пробирку ополаскивают 2 куб. см воды и тоже вносят в патрон. После этого промывают патрон двумя порциями по 5 куб. см ацетонитрила. Все промывки отбрасывают. Ипконазол элюируют 5 куб. см ацетона в чистую круглодонную колбу объемом 10 куб. см и отдувают ацетон в токе азота. Сухой остаток растворяют в 3 куб. см гексана и выдерживают колбочку в ультразвуковой бане в течение 5 мин. Дальнейшую очистку проводят на патроне, заполненном силикагелем 60. В концентрирующий патрон, промытый 3 куб. см гексана, вносят полученный раствор. Патрон промывают два раза по 3 куб. см гексаном и 1 раз 3 куб. см смеси гексан - диэтиловый эфир (50:50, по объему). Промывки отбрасывают. Ипконазол элюируют ацетоном двумя порциями по 5 куб. см. Ацетон удаляют из элюата током азота (с помощью испарителя одноканального). Полученный сухой остаток растворяют в 2,5 куб. см подвижной фазы и 10 куб. мм вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.4. Условия хроматографирования. Ультраэффективный жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы Waters с быстросканирующим УФ-детектором, снабженным дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Колонка 1 - ACQUITY UPLC BEH Phenyl (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе воды и почвы и колонка 2 - ACQUITY UPLC BEH С-18 (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters) при анализе проб зерна и соломы. Температура колонки 30 +/- 1 °С. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 55:45. Скорость потока элюента: 0,25 мл/мин. Рабочая длина волны: 220 нм. Объем вводимой пробы: 10 мкл. Время удерживания ипконазола: 3,3 +/- 0,1 мин. (колонка 1) и 5,3 +/- 0,1 мин. (колонка 2).

Альтернативные условия хроматографирования: жидкостный хроматограф "Breeze" фирмы Waters с УФ-детектором и дегазатором. Рабочая длина волны: 220 нм. Аналитическая колонка Spherisorb Phenyl (Waters) 150 х 4,6 мм, 5 мкм для анализа воды и почвы и Supelcosil С-18 (150 х 4,6) мм, 5 мкм (Sigma-Aldrich) для анализа проб зерна и соломы. Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 50:50 (pH 2,35). Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин. Дозируемый объем: 20 мкл.

Содержание ипконазола в образцах воды, почвы, зерна и соломы зерновых колосовых культур (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ипконазола 1 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.