"МУК 4.1.2479-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение пентахлорфенола в пищевых продуктах. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.02.2009)

1. Разработаны ГУ НИИ питания РАМН.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 декабря 2008 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 февраля 2009 года.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в пищевых продуктах массовых концентраций пентахлорфенола (ПХФ) в диапазоне 0,005 - 1,0 мг/кг.

Предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, находящихся в обращении на территории Российской Федерации, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию.

Методические указания могут быть использованы другими лабораторными центрами, осуществляющими контроль качества и безопасности пищевых продуктов и аккредитованными в установленном порядке.

Общепринятое название: пентахлорфенол (ПХФ).

Название по номенклатуре ИЮПАК: 2,3,4,5,6-пентахлорфенол.

Синонимы: пентахлорфенол, 1-гидроксипентахлорбензол, хлорофен, пенхлорол, пента.

Структурная формула (не приводится).

Мол. масса: 266,34.

CAS номер: 87-86-5.

Физические свойства: белый или слегка коричневатый порошок, с характерным фенольным запахом, температура плавления 190 °C, температура кипения 310 °C, плотность D 1,978 г/куб. см, константа диссоциации рКа 4,7. Растворим в большинстве органических растворителей: ацетон (500 г/л), бензол (150 г/л), этанол (1200 г/л), метанол (1800 г/л); малорастворим в воде (2 г/л). Растворим в маслах.

Форма выпуска: порошок.

Область применения. ПХФ используют в качестве фунгицида, бактерицида, гербицида, инсектицида, а также как консервант древесины.

Гигиенические нормативы. Согласно европейским стандартам содержание ПХФ в воде не должно превышать 9,0 нг/л (WHO, 2001). Установленное U.S.EPA суточное потребление при оральном поступлении ПХФ, вызывающее минимальный риск для здоровья человека, составляет 0,005 мг/кг/сутки, а при хроническом его потреблении - 0,001 мг/кг/сутки.

Рекомендуемый гигиенический норматив для Российской Федерации: содержание пентахлорфенола в пищевых продуктах не допускается (на уровне предела обнаружения метода).

2.1.1. Принцип метода. Методика основана на определении ПХФ в продуктах питания методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с использованием электронозахватного детектора (ЭЗД) после экстракции ПХФ из подкисленной анализируемой пробы органическим растворителем, переэкстракции ПХФ в водную фазу при подщелачивании, подкислении пробы и вновь экстракции ПХФ органическим растворителем. Количественное определение проводится методом внутреннего стандарта после метилирования диазометаном. В качестве внутреннего стандарта используется альдрин.

2.1.2. Метрологические характеристики метода, установленные для разных концентраций ПХФ в пробе.

Примечание. Метрологические характеристики рассчитаны для образцов с содержанием пентахлорфенола 0,02 мг/кг и 1,0 мг/кг.

ГСО 7296-96 альдрина, Государственный инженерный центр "РЕАКТИВ", стандартный образец в ацетоне концентрацией 0,1 мг/мл.

Допускается использование приборов и посуды с метрологическими характеристиками и реактивов квалификацией не ниже указанных в МУК.

Для учета специфики отбора проб отдельных видов продуктов следует руководствоваться действующей нормативно-технической документацией на конкретную продукцию.

Перед анализом пробу образца перемалывают на мясорубке или в кофемолке и тщательно перемешивают в блендере.

2.5.1. Приготовление стандартных растворов ПХФ. Навеску 0,0025 +/- 0,0001 г кристаллического ПХФ количественно переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, растворяют в 150 куб. см гексана, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают основной стандартный раствор в гексане с массовой долей ПХФ 0,01 мг/куб. см.

Для получения рабочих стандартных растворов последовательно разбавляют основной стандартный раствор гексаном. Для этого аликвоты 5,0, 2,0, 1,0 и 0,1 куб. см помещают в мерные колбы вместимостью 100 куб. см и растворы доводят гексаном до метки; получают рабочие стандартные растворы с содержанием ПХФ 0,0005, 0,0002, 0,0001 и 0,00001 мг/куб. см соответственно.

Основной и рабочие стандартные растворы ПХФ хранят в стеклянной посуде (мерной колбе) с притертой пробкой в прохладном месте (при температуре около 0 °C). Сроки годности основного и рабочих стандартных растворов год.

2.5.2. Получение диазометана. Диазометан получают по следующей методике. В реакционную колбу прибора (рис. 1 - здесь и далее рисунки не приводятся) помещают 6 г гидроксида калия, добавляют 3 куб. см метанола и 3 куб. см гидразин гидрата. В приемную колбу наливают 50 куб. см диэтилового эфира. При включенной через холодильник воде из воронки прикапывают со скоростью 1 капля за 1 - 2 с хлороформ. Окончание реакции получения диазометана определяют по появлению белых паров или бурой окраски реакционной смеси. Эфирный раствор диазометана интенсивно-желтого цвета хранят в герметично закрытой темной стеклянной посуде на холоде в течение 3 - 5 дней.

2.5.3. Приготовление рабочих стандартных растворов метиловых эфиров ПХФ. По 0,5 куб. см рабочих стандартных растворов ПХФ помещают в вайлы, растворитель упаривают досуха в токе азота, к остатку добавляют по 1,0 куб. см насыщенного раствора диазометана в эфире.

Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15 - 20 мин., после обесцвечивания растворы досуха упаривают в токе азота и остаток растворяют в 0,2 куб. см гексана. Полученный раствор используют для построения калибровочной кривой (рис. 2).

2.5.4. Приготовление калибровочной смеси стандартных растворов метилового эфира ПХФ и альдрина (внутренний стандарт). 1 куб. см ГСО альдрина помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, доводят гексаном до метки и тщательно перемешивают. Получают стандартный раствор альдрина концентрацией 0,0001 мг/куб. см.

В вайл помещают 0,5 куб. см рабочего стандартного раствора ПХФ концентрацией 0,0001 мг/куб. см (50 нг). Растворитель упаривают досуха в токе азота, к сухому остатку добавляют 1,0 куб. см насыщенного раствора диазометана в эфире. Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15 - 20 мин., после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота, к сухому остатку добавляют 0,2 куб. см стандартного раствора альдрина (20 нг) и растворитель вновь упаривают в токе азота досуха. Полученный остаток растворяют в 0,2 куб. см гексана. Полученный раствор используют для калибровки хроматографа.

2.5.5. Подготовка пробы пищевого продукта для анализа.

2.5.5.1. Приготовление 0,1 М раствора тетрабората натрия. Навеску 38,12 +/- 0,01 г тетрабората натрия декагидрата помещают в мерную колбу вместимостью 1000 куб. см, до половины заполненную дистиллированной водой, перемешивают до полного растворения соли, доводят дистиллированной водой до метки и тщательно перемешивают. Получают раствор буры концентрацией 0,1 М.

2.5.5.2. Приготовление 3,0 М раствора серной кислоты. Мерную колбу вместимостью 100 куб. см до половины заполняют дистиллированной водой. Добавляют 16,75 куб. см концентрированной серной кислоты, раствор взбалтывают, доводят до комнатной температуры и водой доводят до метки, тщательно перемешивают. Получают раствор серной кислоты концентрацией 3,0 М.

2.5.5.3. Подготовка образца. Навеску 1,0 г +/- 0,01 измельченного и перемешанного в блендере образца пищевого продукта помещают в коническую колбу вместимостью 100 куб. см, добавляют 10 куб. см дистиллированной воды, 10 куб. см концентрированной серной кислоты и 10 куб. см смеси гексан-изопропанол (4:1). Смесь встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 30 мин., переносят в центрифужные пробирки, центрифугируют 15 мин. при 2000 об./мин. и отделяют органический супернатант. Экстракцию повторяют дважды с 10 куб. см смеси гексан-изопропанол (4:1) при встряхивании и центрифугировании. Гексановые экстракты объединяют.

Объединенный гексановый экстракт помещают в делительную воронку вместимостью 100 куб. м, добавляют 10 куб. м 0,1 М раствора тетрабората натрия (бура) и смесь встряхивают. Отделяют водную фазу и экстракцию повторяют еще дважды по 10 куб. м раствора буры. Объединенный водный экстракт, при необходимости, центрифугируют и количественно переносят в делительную воронку вместимостью 100 куб. м, подкисляют 3 куб. м 3 М раствора серной кислоты и ПХФ экстрагируют гексаном 3 раза по 10 куб. м. Гексановый экстракт объединяют, сушат над безводным сульфатом натрия, порциями фильтруют через бумажный складчатый фильтр "синяя лента" или, при необходимости, фильтруют через нейлоновый фильтр в вайл и растворитель упаривают досуха в токе азота.

2.5.5.4. Получение метилового производного ПХФ из экстракта пищевого продукта. К полученному сухому остатку добавляют по 1,0 куб. м насыщенного раствора диазометана в эфире.

Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 15 - 20 мин., после обесцвечивания раствор досуха упаривают в токе азота. К сухому остатку добавляют 0,2 куб. см стандартного раствора альдрина концентрацией 0,0001 мг/куб. см (20 нг, внутренний стандарт), растворитель вновь упаривают досуха в токе азота и остаток растворяют в 0,2 куб. см гексана.

2.6.1. Условия ГЖХ анализа. Хроматографическую колонку кондиционируют до минимального дрейфа базовой линии.

Условия ГЖХ: кварцевая капиллярная колонка 50 м, внутренний диаметр 0,32 мм, жидкая фаза полиметилфенилсилоксана (5% фенила) DB-5 или SE-54 или Rtx-5 или HP-5:

температура колонки 250 °C;

температура испарителя 280 °C;

температура детектора 300 °C;

время выхода растворителя 2,5 - 3 мин. (для колонки 50 м).

2.6.2. Анализ пробы. Анализ проводят в условиях ГЖХ, описанных в п. 2.6.1.

Таким образом, масс-спектр исследуемого соединения как по библиотечному поиску, так и по правилам фрагментации соответствует метильному производному ПХФ, масс-спектр которого приведен на рис. 4.

2.7.1. Калибровка хроматографа и построение градуировочной кривой. Хроматографируют по 0,001 куб. см каждого рабочего раствора метилового эфира ПХФ (п. 2.5.3). Хроматографирование проводят трижды и строят график зависимости средних площадей пиков от концентрации ПХФ в мг/куб. см (приложение 1 - не приводится).

2.7.2. Оформление результатов. Расчет содержания ПХФ в анализируемой смеси проводят по формуле:

Для устранения инструментальных ошибок при газовой хроматографии (постоянство температуры колонки, скорости и деления потока газа и др.) применяют метод внутреннего стандарта, в качестве которого используют вещество с близкими физико-химическими и хроматографическими характеристиками (альдрин). При анализе в каждую пробу добавляют точно известное количество альдрина. Хроматографирование проводят дважды, сравнивают отношение площади пика исследуемого вещества к площади пика внутреннего стандарта и результат считают удовлетворительным, если эта величина не превышает 5%.

Допустимое расхождение между параллельными измерениями (R) определяют на основании предела повторяемости (r) (табл. 1):

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами контроля являются рабочие пробы продовольственного сырья, пищевых продуктов и БАД. Отбирают пробу и разделяют ее на 2 равные части. Одну из них оставляют без изменений, а к другой добавляют раствор стандарта ПХФ, такое количество, чтобы его массовая доля в пробе по сравнению с исходным значением увеличилась на 50 - 100%. Добавка должна вводиться в пробу перед началом пробоподготовки.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют с использованием другой пробы.

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

Работу по указанной методике могут исполнять высококвалифицированные специалисты в области газожидкостной хроматографии и санитарной химии. Исполнители должны быть проинструктированы об основных мерах техники безопасности при работе с веществами 1 - 2 класса опасности, органическими растворителями, а также с основными правилами безопасности при работе в химической лаборатории (п. 3).

Помещение лаборатории должно соответствовать санитарным правилам проектирования, оборудования, эксплуатации и содержания производственных и лабораторных помещений, предназначенных для проведения работ с веществами 1 - 2 класса опасности, органическими растворителями. Аналитическая лаборатория должна быть оснащена вентиляционной системой согласно ГОСТ 12.4.021.

Температура окружающего воздуха должна быть от 15 до 25 °C. Относительная влажность воздуха не более 80% при 25 °C. Атмосферное давление 730 - 760 мм рт. ст. Напряжение электропитания 210 - 220 В. Частота переменного тока 45 - 50 Гц.