"МУК 4.1.2344-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств клокуинтоцет-мексила в воде, почве, зерне и соломе зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 29.02.2008)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 29 февраля 2008 г.

4. Введены в действие с 18 мая 2008 г.

5. Введены впервые.

Действующее вещество: клокуинтоцет-мексил.

Структурная формула (не приводится).

1-метилгексил(5-хлорохинолин-8-илокси)ацетат (IUPAC).

Мол. масса: 335,8.

Клокуинтоцет-мексил ускоряет процесс детоксикации некоторых гербицидов в хлебных злаках, повышает устойчивость к ним урожая. Используется в комбинации с этими гербицидами в качестве антидота.

Гигиенические нормативы для клокуинтоцет-мексила в России не установлены.

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств клокуинтоцет-мексила в воде водоемов в диапазоне концентраций 0,002 - 0,02 мг/кг, в почве - 0,01 - 0,1 мг/кг, в зерне хлебных злаков - 0,01 - 0,1 мг/кг и в соломе - 0,04 - 0,4 мг/кг.

Методика основана на определении клокуинтоцет-мексила методом ВЭЖХ с использованием УФ детектора после его извлечения из образцов гексаном или водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Избирательность метода определения клокуинтоцет-мексила достигается условиями подготовки проб и хроматографирования.

Ацетон, ос.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота ортофосфорная, х.ч., ГОСТ 6552-80; 2 М и 0,01 М водные растворы.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Клокуинтоцет-мексил, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,7% (Cheminova).

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 - 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (85:15, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат (50:50, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Аналитическая колонка Nova-Pac Phenyl (150 х 3,9) мм, 4 мкм (Waters).

Предколонка Nova-Pac Phenyl (Waters).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 34104-80Е или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 или аналогичный.

Бидистиллятор.

pH-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Насос водоструйный, МРТУ 42861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25 x 1) см.

Отбор проб производится в соответствии с ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна"; ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; ГОСТ Р 51592-2000 "Вода. Общие требования к отбору проб". Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву доводят до стандартной влажности, просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторной мельнице.

Перед началом анализа колонку (Nova-Pac Phenyl) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 мл/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 куб. дм смешивают 500 куб. см ацетона с 500 куб. см дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,01 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 50:50 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 куб. см смешивают 850 куб. см н-гексана и 150 куб. см этилацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 куб. см смешивают 500 куб. см н-гексана и 500 куб. см этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску клокуинтоцет-мексила (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки. (Стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1, 0,2, 0,5, 1,0 и 2,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - смесь ацетонитрил - 0,01 М ортофосфорная кислота (50:50, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты извлечения клокуинтоцет-мексила используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,2, 2,0 и 10,0 мкг/куб. см готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация клокуинтоцет-мексила в растворе) в хроматограф вводят по 50 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации клокуинтоцет-мексила в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию 5 г силикагеля в 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 куб. см элюента N 2 и 50 куб. см элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 0,1 куб. см стандартного раствора клокуинтоцет-мексила с концентрацией 10 мкг/мл. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °C), остаток растворяют в 5 куб. см элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 куб. см элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 30 куб. см элюента N 1, затем 70 куб. см элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, выпаривают, остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание клокуинтоцет-мексила по п. 2.6.6.

Фракции, содержащие клокуинтоцет-мексил, объединяют, выпаривают досуха, остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.6. Рассчитывают содержание клокуинтоцет-мексила в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания клокуинтоцет-мексила и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

Образец предварительно отфильтрованной воды объемом 100 куб. см помещают в делительную воронку емкостью 250 куб. см и экстрагируют трижды гексаном порциями по 50 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний органический слой. Объединенный гексановый раствор пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г), осушитель промывают 10 - 15 куб. см гексана. После этого экстракт выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. При необходимости проводят дополнительную очистку экстракта на колонке с силикагелем по пункту 2.6.5.

Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

Образец почвы массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см с притертой пробкой, добавляют 100 куб. см 50%-го водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин. в ультразвуковой ванне. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 куб. см 50%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (70 - 75 куб. см) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C. Доводят объем экстракта до 100 куб. см дистиллированной водой. При необходимости (наличие взвеси) раствор дополнительно фильтруют через бумажный фильтр "красная лента".

Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

Навеску размолотого на лабораторной мельнице зерна массой 20 г или измельченной на ножевой мельнице соломы массой 5 г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют клокуинтоцет-мексил 50 куб. см смеси ацетон-вода (1:1, по объему) на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Экстракцию повторяют дважды порциями по 50 куб. см, выдерживая в ультразвуковой ванне каждый раз в течение 15 мин. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят до 100 куб. см дистиллированной водой. При необходимости (наличие взвеси) раствор дополнительно фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

Полученные по пп. 2.6.2 и 2.6.3 водные экстракты помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см и экстрагируют трижды гексаном порциями по 50 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний органический слой <*>. Гексановые экстракты объединяют, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г). Осушитель промывают 10 - 15 куб. см гексана, который также объединяют с экстрактом. После этого гексан выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.5.

--------------------------------

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку на стадии промывки экстрактов гексаном небольшое количество (до 10 куб. см) этилового спирта.

Сухой остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по пп. 2.6.4 экстрактов, количественно переносят двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан-этилацетат (85:15, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 30 куб. см элюента N 1, которые отбрасывают. Клокуинтоцет-мексил элюируют 70 куб. см элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 куб. см. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный. Рабочая длина волны 245 нм. Аналитическая колонка Nova-Pac Phenyl (150 x 3,9) мм, 4 мкм (Waters). Предколонка Nova-Pac Phenyl (Waters) для защиты аналитической колонки. Температура колонки 30 +/- 1 °C.

Скорость потока элюента: 1 мл/мин.

Время удерживания клокуинтоцет-мексила: 12,2 +/- 0,2 мин.

Содержание клокуинтоцет-мексила в образцах воды, почвы, зерна и соломы зерновых колосовых культур (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор клокуинтоцет-мексила 2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения"

(например: менее 0,005 мг/кг*, где * - 0,005 мг/кг - предел обнаружения).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

6.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

6.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

6.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации жидкостного хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 6.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.