"МУК 4.1.2545-09. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пиклорама в семенах и масле рапса методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 09.09.2009)

1. Разработаны: Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Токсикология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 25 июня 2009 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 сентября 2009 г.

4. Введены в действие с 1 декабря 2009 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в семенах и масле рапса массовой концентрации пиклорама в диапазоне 0,1 - 0,01 мг/кг.

Название действующего вещества по ИСО: пиклорам.

Название по ИЮПАК: 4-амино-3,5,6-трихлорпиридил-2-карбоновая кислота.

Структурная формула (не приводится).

В России установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД - 0,02 мг/кг/сутки;

МДУ мг/кг: семена и масло рапса - 0,01.

Пиклорам - гербицид из группы производных карбоновых кислот системного действия, нарушает ауксиновый обмен, вызывая сильное искривление стеблей и черенков листьев. Применяется для борьбы с двудольными и трудноискореняемыми сорняками в посевах зерновых культур и кукурузы, а также для уничтожения горчака розового и других многолетних сорняков.

Предлагается в России для применения в посевах рапса ярового и озимого с нормой расхода 90 г д.в. на га путем опрыскивания посевов в фазе 3 - 4 листьев культуры.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на извлечении пиклорама из семян и масла рапса ацетонитрилом, подкисленным концентрированной соляной кислотой до pH = 1, переэкстракции в эфир, содовый раствор с последующим бутилированием и очистки пробы на колонках с флоризилом. Окончательное определение пиклорама проводится методом ГЖХ с использованием детектора по захвату электронов.

Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

На дно пластиковой хроматографической колонки (высота 15 см, диаметр 1,5 см) помещают пробочку из стекловаты и заполняют колонку флоризилом на высоту 10 см. На слой флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1,0 см. В день очистки экстракта колонку промывают последовательно 15 куб. см ацетона и 15 куб. см гексана, смывы отбрасывают. После промывки колонка готова к работе.

При отработке методики или поступлении новой партии флоризила проводят изучение поведения пиклорама на колонке. В концентратор вносят 1 куб. см стандартного раствор N 3 бутилового эфира пиклорама с концентрацией по пиклораму 0,06 мкг/куб. см, выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C. К сухому остатку добавляют 5 куб. см гексана, растворяют содержимое концентратора и наносят на колонку. Промывают колонку 30 куб. см гексана, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 10 куб. см смеси гексан:ацетон - 4:1, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 15 куб. см смеси гексан:ацетон - 1:1, отбирая последовательно по 5 куб. см элюента. Каждую фракцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторах растворяют в 5 куб. см гексана и вводят в хроматограф 1 куб. мм. По результатам обнаружения пиклорама в каждой фракции определяют объем смеси гексан:ацетон - 1:1, необходимый для полного вымывания пиклорама.

7.3.1. Приготовление подкисленного ацетонитрила. Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

В емкость, содержащую 1 куб. дм ацетонитрила, добавляют 10 куб. см 1 н раствора хлороводородной кислоты до pH 1 и перемешивают содержимое.

7.3.2. Приготовление раствора для бутилирования. Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

В мерную колбу объемом 100 мл осторожно приливают 2 мл концентрированной серной кислоты к н-бутанолу. Перемешивают раствор и доводят объем до метки бутанолом. Бутилирующую смесь хранят под тягой в течение одного месяца. Перед приготовлением раствора н-бутанол перегоняют.

7.3.3. Приготовление раствора 4 н раствора серной кислоты. Раствор готовят под тягой, строго соблюдая технику безопасности.

В мерную колбу объемом 1 литр осторожно приливают 112 мл концентрированной серной кислоты к дистиллированной воде. Осторожно перемешивают раствор, добавляют воды, но не до метки. Когда раствор остынет, его доводят водой до метки.

7.3.4. Приготовление раствора 5% гидрокарбоната натрия. В стакан на 500 мл помещают 50 г гидрокарбоната натрия. Доливают около 200 мл воды и растворяют соду при помощи ультразвуковой ванны, помешивая стеклянной палочкой. Раствор переливают в бутылку. При необходимости процедуру повторяют. Раствор в бутылке доводят водой до 1 л.

7.3.5. Приготовление стандартных растворов. 100 мг пиклорама (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют навеску в ацетоне и доводят объем до метки ацетоном (стандартный раствор N 1, концентрация 1 мг/мл). Раствор хранится в холодильнике около 120 суток.

Методом последовательного разбавления исходного раствора N 1 ацетоном готовят стандартный раствор N 2 с концентрацией 10,0 мкг/мл, который может храниться в холодильнике не более 30 суток.

Для построения градуировочного графика отбирают 1 мл стандартного раствора N 2 в виал, удаляют растворитель током теплого воздуха и проводят бутилирование, как указано в разделе 7.4. Получают стандартный раствор N 3 бутилового эфира пиклорама с концентрацией по пиклораму 1,0 мкг/куб. см.

Для приготовления градуировочных растворов отбирают 1 мл стандартного раствора N 2 (концентрация - 10 мкг/куб. см) в виалу и удаляют растворитель током теплого воздуха. К сухому остатку в виале добавляют 1 куб. см 2% раствора концентрированной серной кислоты в бутаноле. Плотно закрывают виалу крышкой и помещают в нагревательный блок для виал, нагретый до 100 °C. Бутилирование проводят в течение 30 мин.

Далее виалу охлаждают до комнатной температуры и добавляют в нее 10 куб. см гексана и 20 - 25 куб. см дистиллированной воды. Смесь интенсивно встряхивают и выстаивают до полного разделения фаз. Верхний гексановый слой используют для приготовления градуировочных растворов, которые применяют при построении градуировочного графика. Концентрация пиклорама в гексановом растворе составляет 1,0 мкг/куб. см (раствор N 3).

Методом последовательного разбавления раствора бутилового эфира пиклорама N 3 гексаном в мерных колбах готовят рабочие растворы с концентрациями по пиклораму: 0,01; 0,02; 0,04; 0,06 мкг/куб. см, которые могут храниться в холодильнике не более 10 суток.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации пиклорама в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки с концентрацией 0,01; 0,02; 0,04; 0,06 мкг/см.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации пиклорама в растворе в мкг/куб. см.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79) а также в соответствии с ГОСТ 8988-77 "Масло рапсовое. ТУ", ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Семена рапса, подсушенные до стандартной влажности, хранят в тканевых мешочках, в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре не более 6-ти месяцев. Влажные семена замораживают и хранят в морозильной камере при -14 °C до 1 года.

Пробы масла хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °C в течение 10 суток.

Для исследовательских целей допускается получение масла в лаборатории из проб семян методом экстракции горячим растворителем при температуре не выше 40 °C.

9.1.1. Экстракция. Навеску размолотых семян рапса 10 г помещают в центрифужную банку объемом 250 куб. см, добавляют 50 куб. см подкисленного ацетонитрила и проводят экстракцию на ультразвуковой ванне в течение 10 мин. По окончании экстракции пробу центрифугируют 10 мин при 4000 об./мин. Фильтруют экстракт в концентратор емкостью 250 куб. см через воронку с бумажным фильтром. Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 30 куб. см подкисленного ацетонитрила, используя ультразвуковую ванну каждый раз по 5 мин. Объединенный экстракт выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C до капель масла.

К масляному остатку в концентраторе добавляют 5 куб. см ацетона, омывают концентратор и помещают на 5 мин. на ультразвуковую ванну. В концентратор двумя порциями добавляют 100 куб. см воды, ополаскивают стенки концентратора и переносят в делительную воронку.

9.1.2. Очистка методом перераспределения между двумя несмешивающимися растворителями. Добавляют в воронку 5 г хлорида натрия, растворяют его путем встряхивания. Водную фазу подкисляют 4 н раствором серной кислоты до pH 1 (2 куб. см), добавляют 50 куб. см эфира и интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой сливают в тот же концентратор, а верхний эфирный собирают в плоскодонную колбу емкостью 100 куб. см. Водную фракцию возвращают в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще трижды, используя для этого каждый раз 30 куб. см эфира. После этого водную фракцию отбрасывают, эфир переливают в ту же делительную воронку.

К эфиру в воронку добавляют 50 куб. см 5% раствора гидрокарбоната натрия, интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний слой соды собирают в плоскодонную колбу на 100 куб. см. Экстракцию повторяют еще раз, используя 50 куб. см раствора гидрокарбоната натрия. Эфир отбрасывают.

Объединенный содовый экстракт переносят обратно в делительную воронку, дают отстояться, отбрасывают отстоявшийся эфир. После этого экстракт в делительной воронке подкисляют 4 н раствором серной кислоты до pH 1 (2 куб. см). Смесь дегазируют. (Осторожно! Возможно разбрызгивание раствора!)

Приливают 50 куб. см эфира, интенсивно встряхивают смесь в течение 1 - 2 мин. После разделения слоев нижний водный слой собирают в плоскодонную колбу, а верхний эфирный переносят в чистый концентратор емкостью 250 куб. см, пропуская через воронку с безводным сульфатом натрия. Содовую фракцию возвращают в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще трижды, используя для этого каждый раз 30 куб. см эфира. Эфирные экстракты объединяют в концентраторе и выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C досуха. Сухой остаток переносят одной порцией 3 куб. см ацетона и тремя порциями по 5 куб. см диэтилового эфира в виалу и высушивают током теплого воздуха. Проводят бутилирование, как указано в п. 9.1.1.

9.1.3. Бутилирование. К сухому остатку в виале добавляют 1 куб. см 2% раствора концентрированной серной кислоты в бутаноле. Плотно закрывают виалу крышкой и помещают в блок для виал, нагретый до 100 °C. Бутилирование проводят в течение 30 мин. Далее виалу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 10 куб. см гексана, 20 - 25 куб. см дистиллированной воды. Смесь интенсивно встряхивают.

9.1.4. Очистка экстракта на колонке с флоризилом. После разделения слоев из верхнего гексанового слоя пипеткой отбирают аликвоту 5 куб. см и наносят на колонку с флоризилом, подготовленную, как указано в разделе 7.1. Промывают колонку 30 куб. см гексана, смыв отбрасывают. Наносят на колонку 10 куб. см смеси гексан:ацетон - 4:1, смыв отбрасывают. Пропускают через колонку 15 куб. см смеси гексан:ацетон - 1:1, собирая элюат в концентратор емкостью 100 куб. см. Содержимое концентратора выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °C досуха.

Сухой остаток в концентраторе растворяют в 5 куб. см гексана и вводят в хроматограф 1 куб. мм.

Навеску масла 10 г растворяют в 100 куб. см гексана и переносят в делительную воронку. Добавляют в делительную воронку 50 мл подкисленного ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 2 мин. После полного разделения слоев нижний (ацетонитрильный) слой собирают в концентратор 250 куб. см. Повторяют экстракцию еще дважды, используя по 30 куб. см ацетонитрила, встряхивая смесь каждый раз по 2 мин. Объединенный экстракт выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °C до капель масла.

Далее проводят очистку пробы с последующим бутилированием и очисткой на колонке с флоризилом, как указано в разделах 9.1.2; 9.1.3 и 9.1.4.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая HP-1, Methyl Siloxane, длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 340 °C, испарителя - 260 °C, программированный нагрев колонки с 220 °C (выдержка 2 мин.) по 10 °C/мин. до 260 °C (выдержка 5 мин.).

Газ 1: тип регулятора расхода газа РРГ 11, режим нормальный, скорость 25 см/с, давление 137,6 кПа.

Газ 2 (гелий) - 75 куб. см/мин.: расход 0,5 куб. см/мин., сброс 1:150.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 45 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания пиклорама - 5 мин. 2 сек. +/- 2%.

Линейность детектирования сохраняется в пределах - 0,01 - 0,06 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией пиклорама 0,06 мкг/куб. см, соответственно разбавляют.

Количественное определение пиклорама проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов пиклорама с концентрацией 0,01 - 0,06 мкг/куб. см.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание пиклорама рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае, если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева.

Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".