"МУК 4.2.2233-07. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации клеток и спор Bacillus subtilis 24Д - действующего вещества микробиологического фунгицида "Интеграл" в воздухе рабочей зоны. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 06.08.2007)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека (протокол от 29 марта 2007 г. N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 6 августа 2007 г.

3. Разработаны ОАО "Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ".

4. Введены в действие с 1 октября 2007 г.

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций 10 - 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе производственных помещений биотехнологического цеха и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 ГСИ "Методики выполнения измерений".

Штамм Bacillus subtilis 24Д (ВНИИСХМ 129) является действующим веществом микробиологического фунгицида "Интеграл". Выделен из растений хлопчатника. Идентифицирован в Институте микробиологии и вирусологии НАН Украины.

Штамм Bacillus subtilis 24Д характеризуется следующими культурально-морфологическими и биохимическими свойствами: грамположительные аэробные спорообразующие палочки, продуцирующие каталазу. На МПА, сусло-агаре, среде Громыко и картофельном агаре культура растет обильно. На МПА образует складчатые колонии вязкой консистенции, телесного цвета, края колонии неправильной формы. На картофельном агаре - колонии светло-телесного цвета, блестящие, вязкой консистенции края ровные. На сусло-агаре и среде Громыко - колонии телесного цвета, складчатые, с возвышающимся центром, края - изрезанные, консистенция - вязкая.

В мазках 18-часовой культуры обнаруживаются прямые палочковидные клетки размером 1,9 x 0,5 мкм, расположенные одиночно, реже цепочкой. При спорообразовании клетка не раздувается. Споры эллипсовидные - 0,9 x 0,5 мкм, в клетке расположены центрально.

Штамм Bacillus subtilis 24Д ферментирует глюкозу, лактозу, арабинозу, ксилозу, мальтозу, маннит, сахарозу с образованием кислоты; не разлагает дульцит, рамнозу; дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра, гидролизует крахмал, желатин, не гидролизует мочевину; утилизирует цитрат; пропионат не использует. Не растет в анаэробных условиях, не образует включения поли-бета-оксимасляной кислоты на МПА с глюкозой; не обладает летициназной активностью; индол и сероводород не образует. Штамм не патогенен.

Штамм Bacillus subtilis 24Д проявляет антагонистическую активность в отношении фитопатогенных грибов классов фикомицеты, базидиомицеты класса несовершенных грибов, бактерий родов Erwinia, Pseudomonas и Xanthomonas.

Штамм Bacillus subtilis 24Д размножают и хранят на МПА, сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре. Рост при температуре 32 - 34 °C в течение 24 ч.

Для обнаружения штамма применяют посев проб на агаризованные питательные среды с последующим тестированием культуры по типичным морфологическим признакам.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 10 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод измерения концентрации основан на аспирации микробных клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д из воздуха на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.

--------------------------------

<*> Допускается использование аналогичных средств измерений и вспомогательных устройств с техническими характеристиками не ниже, чем у указанных в п. 5.1 данной методики и разрешенных к применению в соответствии с утвержденными в установленном порядке методическими указаниями по методам контроля.

--------------------------------

<*> Допускается использование питательных сред и их компонентов, изготовленных по другой нормативной документации, при условии аналогичного состава и качественных показателей не ниже, чем у указанных в п. 5.2 данной методики.

При выполнении измерений концентрации клеток и спор штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе рабочей зоны соблюдают правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов;

- требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);

- положения "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу, при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

Для определения концентрации микроорганизма производят отбор проб воздуха при помощи аппарата Кротова (п. 5, примечание 1) со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время отбора одной пробы воздуха 20 мин. Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. В период отбора пробы воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги, полиэтилена или другой стерильной емкости.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора пробы с указанием места, времени и условий отбора.

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3 - 4-е сут. после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний.

Подготавливают питательную среду: сусло-агар или среду Громыко. Сусло-агар готовят по общепринятой методике из концентрата сусла пивного неохмеленного (п. 5.2) путем разбавления его дистиллированной водой до общей концентрации сахаров 10% (10° Баллинга), pH 7,0 - 7,2 (при необходимости pH доводят до необходимого значения путем добавления 10%-го раствора гидроокиси натрия) с добавлением 2,0 - 2,5% агар-агара. Среду Громыко готовят по общепринятой методике из мясо-пептонного бульона и сусла пивного неохмеленного с концентрацией сахаров 7% (7° Баллинга), взятых в соотношении 1:1, с добавлением 2,0 - 2,5% агар-агара, pH-среды 7,0 - 7,2. Общую концентрацию сахаров в сусле определяют по ареометру.

Подготовленную среду расплавляют на водяной бане, остужают до 50 - 60 °C и добавляют в нее раствор амфотерицина B в стерильной дистиллированной воде из расчета 10 мкг амфотерицина В на 1 мл питательной среды для подавления посторонней воздушной микофлоры.

У каждой партии подготовленной питательной среды проверяют ростовые свойства. Используемые питательные среды должны обеспечивать рост микроорганизмов Bacillus subtilis 24Д при посеве их в количестве менее 100 жизнеспособных клеток не позднее 24 ч при температуре 32 - 34 °C.

Готовую питательную среду тщательно перемешивают и разливают по 20 мл в стерильные чашки Петри, установленные на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 30 - 35 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

Культивирование проб воздуха, отобранных согласно п. 8.1, ведут в течение 24 ч при температуре 32 - 34 °C с последующим учетом выросших типичных колоний штамма Bacillus subtilis 24Д. При необходимости выросшую культуру подвергают микроскопической идентификации (окраска мазков - по Граму).

Расчет концентрации клеток в перерасчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

где:

К - концентрация штамма Bacillus subtilis 24Д в воздухе, кл./куб. м;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент перерасчета на 1 куб. м воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин.;

Т - время аспирации, мин.

Результаты измерений оформляют протоколом по приведенной форме.

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. "Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкция по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.

5. Государственная фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2. Общие методы анализа. М.: Медицина, 1990.

6. Р 2.2.2006-05 "Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда".