"МУК 4.1.2402-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флутриафола в семенах и масле рапса методом газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 17.07.2008)

1. Разработаны сотрудниками Всероссийского НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 июля 2008 г. N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 1 сентября 2008 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в семенах и масле рапса массовой концентрации флутриафола в диапазоне концентраций 0,025 - 0,25 мг/кг.

Флутриафол

Структурная формула (не приводится)

СА: (+/-)-альфа-(2-фторфенил)-альфа-(4-фторфенил)-1H-1,2,4-триазол-1-этанол

Гигиенические нормативы, МДУ (мг/кг): виноград - н.д., зерно хлебных злаков, свекла сахарная, яблоки, зерно кукурузы, просо, рис, горох, подсолнечник (семена и масло) - 0,05. Для семян и масла рапса гигиенические нормативы не установлены.

Область применения: фунгицид широкого спектра действия для борьбы с болезнями листа и колоса зерновых культур, также применяется для защиты плодовых, зернобобовых и других культур. Используется для борьбы с почвенными, семенными и аэрогенными инфекциями.

Метод определения флутриафола в семенах и масле рапса основан на экстракции пестицида органическими растворителями и очистке перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами, а также, при необходимости, на колонке с силикагелем. Количественное определение проводят методом газожидкостной хроматографии с использованием термоионного детектора (ТИД).

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

Метрологическая характеристика метода представлена в таблицах 1 и 2.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Флутриафол, аналитический стандарт.

Ацетон, ос.ч. 9-5, ТУ 2633-039-4493179-00 или ч.д.а., ГОСТ 2603-79.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-76.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Натрий сернокислый безводный, ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Стекловата.

Силикагель L 100/400 для хроматографии (0,040 - 0,063 мм) (Хе-мапол, Венгрия).

Хлористый метилен, х.ч., ТУ-2631-020-11291058-96.

Газовый хроматограф Цвет-550 М или аналогичный с ТИД и стеклянной насадочной колонкой, длиной 1 м, внутренним диаметром 3 мм.

Ванна ультразвуковая УЗВ/100 ТН, ТУ 3.836.008 или аналогичная.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001.

Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-2001.

Ротационный испаритель вакуумный Buchi R-205 или аналогичный.

Микрошприц МШ-10, МШ-10М, ТУ 2-833-106.

Воронка Бюхнера, ГОСТ 0147.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29-32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные на 500 куб. см, ВД-3-500, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100 куб. см, 500 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Стаканы химические, ГОСТ 25336-82Е.

Колонка стеклянная хроматографическая длиной 30 см, диаметром 10 мм.

Отбор проб семян и масла рапса и сои - ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Для длительного хранения семена рапса подсушивают при комнатной температуре в отсутствие света. Сухие образцы могут храниться в течение года. Перед анализом пробы семян доводят до стандартной влажности и измельчают. Пробы масла рапса хранят в холодильнике при 0 - 4 °C в закрытой стеклянной таре не более 2-х месяцев.

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °C до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

Перед началом анализа колонку, заполненную хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5% SE-30, не присоединяя к детектору, кондиционируют в токе инертного газа (азот) при температуре 250 °C в течение 8 - 10 часов.

Основной раствор флутриафола готовят количественно перенося 10 мг аналитического стандарта флутриафола в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетоне. Из полученного раствора флутриафола с концентрацией 100 мкг/куб. см готовят рабочие растворы с концентрациями 0,5 мкг/куб. см, 1 мкг/куб. см, 2 мкг/куб. см, 4 мкг/куб. см последовательным разведением в ацетоне.

Для внесения в образец при определении полноты извлечения используют соответствующий раствор аналитического стандарта флутриафола в гексане.

Для построения градуировочного графика зависимости высоты (площади) пика от концентрации флутриафола в растворе в хроматограф вводят по 2 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций), измеряют высоты (площади) пиков и строят график зависимости среднего значения высоты, мм (площади, мв/сек.) пика от концентрации флутриафола в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

Силикагель прогревают в термостате при 120 °C в течение 3-х часов и охлаждают до комнатной температуры. На дно стеклянной колонки помещают стекловату, слой 0,5 см безводного сульфата натрия и заполняют через воронку суспензией 5 г силикагеля в 25 куб. см гексана при открытом кране колонки, сверху наносят слой 1 см безводного сульфата натрия. Затем колонку промывают 10 куб. см смеси гексан:ацетон в соотношении 90:10 и закрывают кран, когда уровень растворителя достигнет верхнего края сорбента. Колонка готова к работе.

В подготовленную колонку пипеткой вносят 1 куб. см стандартного раствора флутриафола в гексане и дают впитаться. После этого в колонку вносят 10 куб. см смеси гексан:ацетон 60:40), элюат отбрасывают. Флутриафол элюируют 40 куб. см смеси гексан:ацетон (15:85), отбирая фракции по 5 куб. см, упаривают досуха, остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Фракции, содержащие флутриафол, объединяют, выпаривают досуха, остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Рассчитывают содержание флутриафола в элюате, определяя его полноту извлечения из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: профиль вымывания флутриафола может изменяться при использовании силикагеля новой партии или другой марки.

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

2.6.1.1. Семена рапса. Навеску раздавленных в фарфоровой ступке семян (20 г) помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, смачивают 50 куб. см теплой дистиллированной воды и оставляют на 30 мин. для набухания. Затем добавляют 100 куб. см ацетона и экстрагируют флутриафол в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Экстракт фильтруют через фильтр "белая лента" на воронке Бюхнера. Экстракцию повторяют дважды. Объединенный фильтрат переносят в делительную воронку объемом 500 куб. см, добавляют 30 куб. см гексана и встряхивают в течение 2 - 3 мин. После полного разделения фаз нижний водно-ацетоновый слой собирают, при этом эмульсию пограничного слоя разбивают непосредственно перед тем, как предстоит отбор эмульсионного слоя, внесением в него очень малого количества хлористого натрия. Оставшийся в делительной воронке гексановый слой промывают дважды 50 куб. см водного ацетона (50:50), который собирают. Объединенный водно-ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C до объема 150 - 180 куб. см и переносят в делительную воронку. Флутриафол переэкстрагируют в хлористый метилен трижды порциями по 50 мл, встряхивая делительную воронку в течение 2-х минут. Нижний органический слой собирают, фильтруя через слой безводного сульфата натрия, и выпаривают досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетона и дальнейшую очистку проводят на колонке с силикагелем (п. 2.6.2).

2.6.1.2. Масло рапса. 20 г масла помещают в делительную воронку объемом 500 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси гексан:ацетон в соотношении 2:1 и осторожно круговыми движениями перемешивают в течение 2 - 3 минут. Затем добавляют 50 куб. см дистиллированной воды и встряхивают воронку в течение двух минут, происходит разделение слоев и перераспределение флутриафола в водно-ацетоновый слой, который собирают. К гексановому слою в делительной воронке добавляют 50 куб. см водного ацетона (50:50), интенсивно встряхивают и после полного разделения фаз собирают водно-ацетоновый слой. Промывку гексанового слоя повторяют. Собранный водно-ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C до объема 120 - 150 куб. см и переносят в чистую делительную воронку. Флутриафол переэкстрагируют в хлористый метилен трижды порциями по 50 куб. см. Органический слой фильтруют через безводный сульфат натрия и выпаривают досуха на роторном испарителе. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (90:10) и дальнейшую очистку проводят на колонке с силикагелем (п. 2.6.2).

Растворенный в 2 куб. см смеси гексан:ацетон (90:10) сухой остаток пипеткой количественно переносят в хроматографическую колонку, колбочку ополаскивают еще 1 - 2 куб. см той же смеси и вносят в колонку, после чего открывают кран и дают раствору впитаться в сорбент. Затем в колонку вносят 10 куб. см смеси гексан:ацетон в соотношении 60:40, элюат отбрасывают. Флутриафол элюируют 15 куб. см смеси гексан:ацетон в соотношении 15:85, элюат собирают и упаривают досуха. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют.

Газовый хроматограф Цвет-550 М с ТИД или аналогичный. Колонка стеклянная 1 м х 3 мм, заполненная хроматоном N-Super (0,125 - 0,160 мм) с 5% SE-30.

Температура колонки 220 °C, испарителя 240 °C, детектора 380 °C.

Скорость газоносителя (азот) через колонку 35 куб. см/мин.

Расход водорода 17 куб. см/мин.

Расход воздуха 200 куб. см/мин.

Объем вводимой пробы 2 куб. мм. Время удерживания флутриафола 2,40 мин. +/- 0,05 мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание флутриафола в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств флутриафола в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор флутриафола 100 мкг/куб. см, разбавляют.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,025 мг/кг*, где * - 0,025 мг/кг - предел обнаружения в семенах и масле рапса)".

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.