"МУК 4.1.2300-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств нафталевого ангидрида в почве, зерне и соломе зерновых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 25.10.2007)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, О.С. Юзихин).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 21.06.2007 N 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 25 октября 2007 г.

4. Введены в действие с 25 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Торговое наименование препарата: Грассер, ЭМВ (нафталевый ангидрид входит в состав препарата в качестве антидота).

Фирма-производитель: ООО "СибАгрохим".

Действующее вещество: нафталевый ангидрид.

Структурная формула (не приводится).

Ангидрид нафталин-1,8-дикарбоновой кислоты (IUPAC).

Мол. масса: 198,17.

Растворим в диметилформамиде (13,9 г/куб. дм), хлороформе, слаборастворим в неполярных растворителях, в гексане, а также эфире, спирте, легко - в ледяной уксусной кислоте, относительно нерастворим в воде.

Стабилен при pH 7, в кислой среде разлагается до нафталевой кислоты. Не гигроскопичен.

Область применения: нафталевый ангидрид ускоряет процесс детоксикации некоторых гербицидов в хлебных злаках, повышает устойчивость к ним урожая. Используется в комбинации с этими гербицидами в качестве антидота.

Гигиенические нормативы для нафталевого ангидрида в России не установлены.

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает методику определения остаточных количеств нафталевого ангидрида в почве в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в зерне зерновых колосовых культур - в диапазоне 0,01 - 0,1 мг/кг, в соломе 0,04 - 0,4 мг/кг.

Методика основана на определении нафталевого ангидрида методом ВЭЖХ с использованием УФ-детектора после его извлечения из образцов водно-ацетоновой смесью с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и на колонке с силикагелем.

2.1.2. Метрологическая характеристика метода

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

2.1.3. Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

Ацетон, осч, ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил для ВЭЖХ, "В-230НМ" или х.ч., ТУ 6-09-3534-87.

Бумажные фильтры "красная лента", ТУ 6.091678-86.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 6709-79.

Калий углекислый, х.ч., ГОСТ 4221-76.

Калия перманганат, ГОСТ 20490-75.

Кальция хлорид, х.ч., ГОСТ 4161-77.

Кислота серная, х.ч., ГОСТ 4204-77.

Нафталевый ангидрид, аналитический стандарт с содержанием д.в. 97% (Weil GmbH).

Натрий двууглекислый, ГОСТ 83-79.

Натрий сернокислый безводный, ч., ГОСТ 4166-76, свежепрокаленный.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Натрия гидроксид, х.ч., ГОСТ 4328-77.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрил - вода (35:65, по объему).

Силикагель для колоночной хроматографии 60 (0,040 - 0,063 mm) (Merck, Германия).

Стекловата.

Фосфора пентоксид, ч., МРТУ 6-09-5759-69.

Элюент N 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (90:10, по объему).

Элюент N 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан - этилацетат (50:50, по объему).

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 22300-76.

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником или аналогичный.

Аналитическая колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters).

Предколонка Symmetry С-18 (Waters).

Весы аналитические ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001, или аналогичные.

Установка ультразвуковая "Серьга", ТУ 3.836.008.

Мельница ножевая РМ-120 и лабораторная зерновая ЛМЗ, ТУ 1-01-0593-79.

Ротационный испаритель вакуумный ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичный.

Бидистиллятор.

pH-метр универсальный ЭВ-74, ГОСТ 22261-76.

Насос водоструйный, МРТУ 42861-64.

Колбы плоскодонные на шлифах КШ500 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Колбы круглодонные на шлифах КШ50 29/32 ТС, ГОСТ 10384-72.

Воронки лабораторные В-75-110, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные ВД-3-250, ГОСТ 8613-75.

Цилиндры мерные на 100, 250 и 1000 куб. см, ГОСТ 1774-74.

Колбы мерные на 25, 50, 100 и 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Пипетки на 1, 2, 5, 10 куб. см, ГОСТ 22292-74.

Колонки стеклянные (25 х 1) см.

Отбор проб почвы производится в соответствии с ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб"; зерна - по ГОСТ Р 50436-92 (ИСО 950-79) "Зерновые. Отбор проб зерна". Пробы зерна и соломы для определения остатков в урожае хранят в бумажной или тканевой упаковке при комнатной температуре. Для длительного хранения пробы почвы подсушиваются при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому измельчают на лабораторной мельнице.

2.5.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

2.5.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (Symmetry С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (1 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.5.3. Приготовление растворов

Для получения 50%-го водного ацетона в колбе емкостью 1 куб. дм смешивают 500 куб. см ацетона с 500 куб. см дистиллированной воды, используя мерные цилиндры.

Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с бидистиллированной водой в соотношении 35:65 по объему, используя мерные цилиндры.

Для приготовления насыщенного раствора хлорида натрия 380 г NaCl растворяют при нагревании в 1 куб. дм дистиллированной воды, полученный раствор фильтруют через фильтр "красная лента" и охлаждают до комнатной температуры.

Для приготовления элюента N 1 в колбе на 1000 куб. см смешивают 900 куб. см н-гексана и 100 куб. см этилацетата. Для приготовления элюента N 2 в колбе на 1000 куб. см смешивают 500 куб. см н-гексана и 500 куб. см этилацетата.

Приготовление стандартного и градуировочных растворов:

Берут точную навеску нафталевого ангидрида (50 мг), переносят в мерную колбу на 100 куб. см, растворяют навеску в ацетонитриле и доводят до метки (стандартный раствор с концентрацией 0,5 мг/ куб. см). Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 и 2,0 мкг/куб. см готовят методом последовательного разбавления по объему, используя раствор подвижной фазы - смесь ацетонитрил - вода (50:50, по объему).

Стандартный раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в течение 1 месяца, градуировочные растворы - в течение суток.

При изучении полноты извлечения нафталевого ангидрида используют ацетонитрильные растворы вещества. Растворы внесения с концентрациями 0,2; 2,0 и 10,0 мкг/куб. см готовят из стандартного раствора с концентрацией 0,5 мг/куб. см методом последовательного разбавления по объему ацетонитрилом.

2.5.4. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация нафталевого ангидрида в растворе) в хроматограф вводят по 50 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации нафталевого ангидрида в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

2.5.5. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 1 см помещают тампон из стекловаты, закрывают кран и вносят суспензию: 5 г силикагеля в 30 куб. см смеси гексан - этилацетат (90:10, по объему). Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента. Колонку последовательно промывают 50 куб. см элюента N 2 и 50 куб. см элюента N 1 со скоростью 1 - 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

2.5.6. Проверка хроматографического поведения нафталевого ангидрида на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу емкостью 10 куб. см отбирают 0,1 куб. см стандартного раствора нафталевого ангидрида с концентрацией 10 мкг/куб. см. Отдувают растворитель током теплого воздуха (температура не выше 40 °С), остаток растворяют в 5 куб. см элюента N 1 и наносят на колонку. Колбу обмывают еще 5 куб. см элюента N 1 и также вносят на колонку. Промывают колонку 50 куб. см элюента N 1, затем 70 куб. см элюента N 2 со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 10 куб. см каждая, выпаривают досуха, остаток растворяют в 1 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.3) и анализируют на содержание нафталевого ангидрида по п. 2.6.5.

Фракции, содержащие нафталевый ангидрид, объединяют, выпаривают досуха, остаток растворяют в 1 мл подвижной фазы для ВЭЖХ и вновь анализируют по п. 2.6.5. Рассчитывают содержание нафталевого ангидрида в элюате, определяя полноту вымывания вещества из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: параметры удерживания нафталевого ангидрида и сопутствующих экстрактивных веществ могут меняться при использовании новой партии сорбента и растворителей.

2.6.1. Извлечение нафталевого ангидрида из проб почвы

Образец воздушно-сухой почвы массой 20 г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см с притертой пробкой, добавляют 50 куб. см 50%-ного водного ацетона и экстрагируют в течение 15 мин. на ультразвуковой бане. Суспензию фильтруют на стеклянной воронке через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 куб. см 50%-ного водного ацетона. Объединенные экстракты упаривают до водного остатка (70 - 75 см) на роторном испарителе при температуре не выше 40 °С. Доводят объем экстракта до 100 куб. см насыщенным раствором хлорида натрия. При необходимости (наличие взвеси) раствор дополнительно фильтруют через бумажный фильтр "красная лента".

Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

2.6.2. Извлечение нафталевого ангидрида из проб зерна и соломы зерновых колосовых культур

Навеску размолотого на лабораторной мельнице зерна массой 20 г или измельченной на ножевой мельнице соломы массой 5 г помещают в коническую колбу емкостью 250 куб. см и экстрагируют нафталевый ангидрид 50 куб. см смеси ацетон - вода (1:1, по объему) на ультразвуковой установке в течение 15 мин. Суспензию фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Осадок с фильтра количественно переносят назад в колбу и экстракцию повторяют с 50 куб. см 50%-ного водного ацетона, выдерживая в ультразвуковой ванне в течение 15 мин. Экстракцию повторяют. Объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до полного удаления ацетона. Объем водного остатка доводят до 100 см насыщенного раствора хлорида натрия. При необходимости (наличие взвеси) раствор дополнительно фильтруют через бумажный фильтр "красная лента". Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.3.

2.6.3. Очистка экстрактов

Полученные по п. п. 2.6.1 и 2.6.2 водные экстракты помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см и экстрагируют трижды гексаном порциями по 50 куб. см, встряхивая делительную воронку каждый раз в течение 2 - 3 мин. и собирая верхний органический слой <*>. Гексановые экстракты объединяют, пропускают через слой безводного сульфата натрия (2 г). Осушитель промывают 10 - 15 куб. см гексана, который также объединяют с экстрактом. После этого гексан выпаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Дальнейшую очистку экстракта проводят по пункту 2.6.4.

--------------------------------

<*> В случае образования сравнительно стойких эмульсий для сокращения времени расслоения можно добавить в делительную воронку на стадии промывки экстрактов гексаном небольшое количество (до 10 куб. см) этилового спирта.

2.6.4. Очистка на колонке с силикагелем

Сухой остаток в колбе, полученный при выпаривании очищенных по п. 2.6.3 экстрактов, количественно переносят двумя порциями по 5 куб. см смеси гексан - этилацетат (90:10, по объему) в кондиционированную хроматографическую колонку (п. 2.5.5). Промывают колонку 50 куб. см элюента N 1, который отбрасывают. Нафталевый ангидрид элюируют 70 куб. см элюента N 2, собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 куб. см. Раствор выпаривают досуха на вакуумном ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С. Сухой остаток растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 50 куб. мм раствора вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.5. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф "Альянс" фирмы "Waters" с УФ-детектором (Waters 2487) с дегазатором и автоматическим пробоотборником.

Рабочая длина волны 331 нм.

Аналитическая колонка Symmetry С-18 (250 х 4,6) мм, 5 мкм (Waters, USA).

Предколонка Symmetry С-18 (Waters) для защиты аналитической колонки.

Температура колонки 30 +/- 1 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - вода в соотношении 35:65 (по объему).

Скорость потока элюента: 1 куб. см/мин.

Время удерживания нафталевого ангидрида 11,6 +/- 0,2 мин.

2.6.6. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание нафталевого ангидрида в образцах почвы, зерна и соломы зерновых колосовых культур (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

Содержание остаточных количеств нафталевого ангидрида в анализируемом образце вычисляют как среднее из 2-х параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор нафталевого ангидрида 2 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг <*>).

--------------------------------

<*> 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.

Долженко В.И., Цибульская И.А., Юзихин О.С.

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений, Санкт-Петербург.