"МУК 4.1.2336-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств хизалофоп-П-этила в зеленой массе рапса, семенах и масле рапса и сои по основному метаболиту хизалофоп-П кислоте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 15.02.2008)

1. Разработаны Всероссийским НИИ защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по защите прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 15 февраля 2008 г.

4. Введены в действие с 10 апреля 2008 г.

5. Введены впервые.

Краткая характеристика препарата:

Действующее вещество (д.в.): хизалофоп-П-этил.

Название д.в. по номенклатуре ИЮПАК: (R)-2-[4-[(6-хлор-хиноксалин-2-илокси)-фенокси] пропионовой кислоты этиловый эфир.

Структурная формула д.в. (не приводится).

Гигиенические нормативы: ВМДУ в сое (семена, масло) - 0,05 мг/кг.

Область применения: гербицид системного действия, применяется для борьбы с однолетними и многолетними злаковыми сорняками на различных культурах, в том числе на посевах сои и рапса.

Краткая характеристика хизалофоп-П кислоты.

Название по номенклатуре ИЮПАК: (R)-2-[4-[(6-хлорхиноксалин-2-илокси)фенокси] пропионовая кислота.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса д.в.: 344,8.

2.1.1. Область применения и принцип метода

Настоящий документ устанавливает метод определения остаточных количеств хизалофоп-П-этила в зеленой массе рапса, семенах и масле рапса и сои в диапазоне концентраций 0,025 - 0,25 мг/кг. Метод основан на количественном определении хизалофоп-П кислоты, основного метаболита хизалофоп-П-этила, и включает извлечение остаточных количеств хизалофоп-П кислоты из анализируемого объекта органическими растворителями, очистку экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на патронах с силикагелем (Bond Elut). Количественное определение проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектором.

2.1.2. Избирательность метода

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографического анализа.

2.1.3. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Аналитический стандарт хизалофоп-П кислоты.

Ацетон, осч, ТУ 2633-004-11291058-94.

Ацетонитрил для ВЭЖХ "В-230НМ" или хч, ТУ 6-09-3534-87.

Вода бидистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, х.ч., ТУ 2631-003-05807999-98, свежеперегнанный.

Кислота ортофосфорная, хч, ГОСТ 6552-80; 2М и 0,005М водный раствор.

Натрий сернокислый б/в, чда, ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, чда, ГОСТ 4233-77.

Соляная кислота, хч, ГОСТ 3118-77.

Спирт метиловый, хч, ГОСТ 6995-77.

Стекловата.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ 2642-001-42624157-98.

Этиловый эфир уксусной кислоты, хч, ГОСТ 22300-76.

Эфир диэтиловый, ОСТ 84-2006-88.

Элюент N 1 для концентрирующего патрона: смесь этилацетат - метанол (80:20).

Элюент N 2 для концентрирующего патрона: смесь этилацетат - метнол (60:40, по объему).

Концентрирующие патроны Bond Elut марки SI Silica В, 500 мг (Varian) или заполненные силикагелем марки Kieselgel 60 (0,040 - 0,063) мм.

Подвижная фаза для ВЭЖХ: ацетонитрил - 0,005М ортофосфорная кислота (50:50).

Жидкостный хроматограф "ACQUITY" фирмы "Waters" с быстро-сканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки, или хроматограф "Breeze" с УФ-детектором или аналогичный.

Колонка ACQUITY UPLC ВЕН С-18, (100 х 2,1) мм, 1,7 мкм (Waters).

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73, или аналогичный.

Баня ультразвуковая "Серьга" УЗМ002 или аналогичная.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001.

Воронки делительные емкостью 250 и 500 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Индикаторная бумага универсальная, ТУ 6-09-1181-76.

Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Ротационный вакуумный испаритель типа ИР-1 или аналогичный.

Пипетки мерные емкостью 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Пробирки мерные со шлифом емкостью 5,0 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Стаканы химические на 100, 200 и 500 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Установка для упаривания растворителей в токе азота.

Шприц для ввода образцов в концентрирующий патрон.

2.4.1. Подготовка растворителей и приготовление растворов

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °С до объема 1,0 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

Для приготовления подвижной фазы в колбе емкостью 1 куб. дм смешивают 500 куб. см ацетонитрила с 500 куб. см 0,005М раствора ортофосфорной кислоты.

2.4.2. Кондиционирование колонки

Перед началом анализа колонку (ВЕН С-18) кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,25 куб. см/мин.) до стабилизации нулевой линии в течение 1 - 2 часов.

2.4.3. Приготовление стандартных растворов

Основной раствор хизалофоп-П кислоты с содержанием 100 мкг/куб. см готовят растворением в ацетонитриле 0,01 г аналитического стандарта в мерной колбе емкостью 100 куб. см. Раствор хранят в холодильнике при температуре +4 - 6 °С не более двух недель.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,1; 0,2; 0,5; 0,75 и 1,0 мкг/куб. см готовят из основного стандартного раствора хизалофоп-П кислоты последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ непосредственно в день проведения анализа.

При определении полноты извлечения хизалофоп-П-этила из модельных матриц используют растворы, приготовленные из основного стандартного раствора последовательным разбавлением ацетонитрилом.

2.4.4. Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 10 мкл приготовленных по п. 2.4.2 растворов, содержащих хизалофоп-П кислоту. Осуществляют не менее трех параллельных измерений и находят среднее значение высоты (площади) хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты (площади) хроматографического пика в мм (мв х сек.) от концентрации хизалофоп-П кислоты в рабочем растворе в мкг/куб. см.

2.4.5. Подготовка концентрирующего патрона для очистки экстракта

Концентрирующий патрон промывают последовательно с помощью шприца 5 куб. см бидистиллированной воды и 5 куб. см ацетонитрила со скоростью 5 куб. см/мин. Затем промывают патрон 3 куб. см этилацетата. Элюаты отбрасывают.

Отбор проб семян рапса и сои производится в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". Семена хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Масло рапса и сои хранят в холодильнике при температуре 0 - 4 °С в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

2.6.1. Экстракция хизалофоп-П

2.6.1.1. Зерно сои и зеленая масса и семена рапса

Навеску измельченных семян или зеленой массы рапса (10 г) помещают в плоскодонную колбу емкостью 250 куб. см и добавляют 100 куб. см смеси ацетонитрил - бидистиллированная вода (80:20, по объему) и помещают в УЗ-баню на 10 мин. Суспензию фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Растительный материал повторно экстрагируют 50 куб. см той же смеси на УЗ-бане в течение 5 мин.

Из объединенного экстракта отбирают аликвоту (около 70 куб. см), соответствующую 5 г зерна сои, семян или зеленой массы рапса. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.2.

2.6.1.2. Масло сои и рапса

Навеску масла (5 г) растворяют в 20 куб. см гексана в конической колбе на 150 куб. см, затем приливают 50 куб. см 80%-ного ацетонитрила и эмульсию энергично перемешивают в течение 30 мин. на аппарате для встряхивания. Ацетонитрильный слой осторожно декантируют в делительную воронку емкостью 200 куб. см, а к оставшемуся маслу добавляют 50 куб. см 80%-ного ацетонитрила и эмульсию перемешивают на аппарате для встряхивания 30 мин. Эмульсию количественно переносят в ту же делительную воронку, которую помещают в холодильник на 30 мин. для четкого разделения слоев. Отделяют ацетонитрильную фазу и пропускают ее через слой ваты в грушевидную колбу емкостью 200 куб. см. Дальнейшую очистку проводят по п. 2.6.2.

2.6.2. Очистка экстрактов

2.6.2.1. Очистка переэкстракцией

Отобранные аликвоты экстрактов, полученных по п. 2.6.1, упаривают на роторном испарителе до объема 7 - 10 куб. см при температуре 40 °С. Водный остаток переносят в делительную воронку емкостью 100 куб. см, приливают 15 куб. см бидистиллированной воды, 20 куб. см гексана и смесь встряхивают в течение 1 мин. Верхний органический слой отбрасывают. Водную фазу подкисляют 1 н соляной кислотой до рН 2, переносят в делительную воронку, прибавляют 20 куб. см диэтилового эфира и смесь встряхивают 1 мин. Собирают органический слой, а экстракцию водной фазы повторяют дважды по 10 куб. см диэтилового эфира. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.

2.6.2.2. Очистка на патронах с силикагелем

Остаток в колбе, полученный после упаривания очищенных по п. 2.6.2.1 экстрактов, растворяют в 2 куб. см этилацетата и раствор переносят на предварительно промытый 3 куб. см этилацетата концентрирующий патрон Bond Elut. Затем патрон промывают двумя порциями по 2 куб. см этилацетата и двумя порциями по 2 куб. см элюента N 1 (смеси этилацетат - метанол = 80:20). Элюаты отбрасывают. Хизалофоп-П элюируют 4 куб. см элюента N 2 (смеси этилацетат - метанол = 60:40). Элюат собирают в грушевидную колбу-концентратор и выпаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 1,25 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ и 10 куб. мм вводят в жидкостный хроматограф.

2.6.3. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с УФ-детектором Acuity (Waters, USA).

Колонка стальная длиной 10 см, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная октадецилсиликагелем зернением 1,7 мкм (ВЕН С18). Температура колонки 30 +/- 1 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,005М ортофосфорная кислота (50:50). Скорость потока элюента 0,25 куб. см/мин.

Рабочая длина волны 235 нм.

Дозируемый объем 10 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования 1 - 10 нг.

Время удерживания хизалофоп-П кислоты 4,05 +/- 0,05 мин.

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки, содержание хизалофоп-П кислоты в пробе (Х, мг/кг) вычисляют по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,005 мг/кг <*>)

--------------------------------

<*> 0,005 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1.005-88).

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа и работе с электроустановками необходимо соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и требования инструкций по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.