"МУК 4.1.2679-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств гидразида малеиновой кислоты (малеинового гидразида) в почве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.08.2010)

1. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 N 1).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 августа 2010 г.

3. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Малеинового гидразида в почве в диапазоне 4,0 - 40,0 мг/кг.

Название действующего вещества по ИЮПАК: 6-гидрокси-2Н-пирадизин-3-он.

Структурная формула: (не приводится).

Молекулярная масса: 112,1.

Цвет, запах: химически чистый Малеиновый гидразид представляет собой твердый белый порошок без запаха.

Температура плавления: 298 - 300 °C.

Плотность: 1,61 г/мл.

Растворимость в воде: 4,417 г/л (pH 4,3; 25 °C), 144 г/л (pH 7; 20 °C), 145,8 г/л (pH 9; 20 °C).

Растворимость в органических растворителях: метанол - 4,179 г/л, толуол - менее 1 мг/л, гексан - менее 1 мг/л, ацетон - 188 мг/л, этилацетат - 35,9 мг/л, 1,2-дихлорэтан - менее 4 мг/л.

Устойчив к гидролизу при pH 3,6 и 9 (при 45 °C).

Разлагается окислителями и сильными кислотами, при хранении в упаковке при комнатной температуре стабилен более 1 года.

Слабая кислота: pKa - 5,62 (при 20 °C).

Краткая токсикологическая характеристика

Область применения

Малеиновый гидразид - регулятор роста растений, проникает в растения через листья и корни, переходя в ксилему и флоэму. Эффективен как ингибитор деления клеток в меристематических тканях, но не препятствует росту клеток. Также обладает небольшой гербицидной активностью.

Малеиновый гидразид используется для подавления роста травы по краям дорог, на набережных, местах отдыха, а также для замедления роста кустарников и деревьев. Ингибирует прорастание картофеля, лука, свеклы, брюквы и моркови при хранении. Используется как гербицид в смеси с 2,4-D. Норма расхода 1,2 - 5,4 кг/га.

В России для гидразида малеиновой кислоты установлены следующие гигиенические нормативы: ПДК в почве - 4,0 мг/кг; МДУ в клубнях картофеля, корнеплодах моркови, свеклы сахарной и столовой, луке-репке, чесноке, томатах, арбузах, табаке - 8,0 мг/кг.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Метод основан на определении Малеинового гидразида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием диодно-матричного детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем и очистки экстракта на концентрирующих патронах Диапак C16.

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы, использованием специфической длины волны спектра поглощения и выбором колонок различной полярности.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, построение калибровочной кривой.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный хлористый кальций из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем ацетонитрил сливают с осушителя в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см аппарата для перегонки растворителей.

Ацетонитрил перегоняют при температуре 81,5 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 81,5 °C, отбрасывают.

7.1.2. Очистка метанола

Метанол, содержащий воду, предварительно осушают, добавляя в него гранулированный безводный углекислый калий из расчета не менее 100 г/куб. дм. Выдерживают его над осушителем в течение 5 - 6 часов. Затем метанол фильтруют через фильтр "красная лента" в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей.

Метанол перегоняют при температуре 65 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 64,7 °C, отбрасывают.

7.1.3. Приготовление бидистиллированной воды

Дистиллят помещают в круглодонную колбу со шлифом объемом 4000 куб. см от аппарата для перегонки растворителей, добавляют к нему марганцовокислый калий из расчета 1 г/куб. дм и кипятят в течение 6 часов.

Собирают фракции, отогнанные при температуре 100,0 °C, а фракции, отогнанные при температуре ниже и выше 100,0 °C, отбрасывают.

7.2.1. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанный ацетонитрил, очищенную воду и муравьиную кислоту.

В плоскодонную колбу объемом 1000 куб. см помещают 990 куб. см ацетонитрила, 10 куб. см очищенной воды и 4 куб. см муравьиной кислоты. pH должен быть 2 - 2,2. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 мин., после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 мин.

7.2.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.2.1. Стандартный раствор N 1 с концентрацией Малеинового гидразида 1,0 мг/куб. см. Взвешивают 50 мг Малеинового гидразида в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в подвижной фазе и доводят объем до метки подвижной фазой. Полученный стандартный раствор N 1 используется для приготовления стандартных растворов для хроматографического исследования и построения калибровочной кривой.

7.2.2.2. Стандартный раствор N 2 с концентрацией Малеинового гидразида 100,0 мкг/куб. см. Из стандартного раствора N 1 отбирают пипеткой 10 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки подвижной фазой. Стандартный раствор N 2 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.2.3. Стандартный раствор N 3 с концентрацией Малеинового гидразида 20,0 мкг/куб. см. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 10 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 50 куб. см и доводят объем до метки подвижной фазой. Стандартный раствор N 3 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.2.4. Стандартный раствор N 4 с концентрацией Малеинового гидразида 10,0 мкг/куб. см. Из стандартного раствора N 2 отбирают пипеткой 10 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки подвижной фазой. Стандартный раствор N 4 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.2.5. Стандартный раствор N 5 с концентрацией Малеинового гидразида 5,0 мкг/куб. см. Из стандартного раствора N 4 отбирают пипеткой 5 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 10 куб. см и доводят объем до метки подвижной фазой. Стандартный раствор N 5 используется для построения калибровочной кривой.

7.2.2.6. Стандартные растворы с концентрацией Малеинового гидразида 400, 200, 80 и 40 мкг/куб. см для внесения в образцы. Методом последовательного разведения подвижной фазой стандартных растворов N 1 и N 2 готовят растворы, содержащие по 400, 200, 80, 40 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в контрольные образцы почвы.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Малеинового гидразида в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 100,0; 20,0; 10,0 и 5,0 мкг/куб. см. В инжектор хроматографа вводят по 5 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5-ти параллельных измерений.

7.4.1. Подготовка концентрирующих патронов Диапак C16 для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак C16 устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 куб. см подвижной фазы. Элюаты отбрасывают. Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения Малеинового гидразида на концентрирующих патронах Диапак C16

Из стандартного раствора Малеинового гидразида в подвижной фазе, содержащего 40 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в цилиндр объемом 10 куб. см, прибавляют 6 куб. см подвижной фазы, перемешивают и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 5 куб. см подвижной фазы и хроматографируют. Исходный цилиндр обмывают 10 куб. см подвижной фазы и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см, упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C, сухой остаток растворяют в 5 куб. см подвижной фазы и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Малеиновый гидразид, и полноту смывания с колонки.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Zorbax Eclipse устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 30 °C и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 часа.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 1743.01-83 "Почвы. Общие требования к отбору проб", ГОСТ 26950-89 "Почвы. Отбор проб".

Для длительного хранения пробы почвы подсушивают при комнатной температуре в отсутствие прямого солнечного света. Сухие почвенные образцы могут храниться в темной таре в течение года. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм.

9.1.1. Экстракция

Пробу почвы массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции и центрифугирования объемом 200 куб. см, прибавляют к ней 10 куб. см воды и выдерживают 10 мин. при комнатной температуре. Малеиновый гидразид экстрагируют 30 куб. см метанола, добавляя каждый раз при экстракции по 1 куб. см 0,1 н соляной кислоты. Экстрагируют в течение 5 минут в ультразвуковой ванне и 30 мин. на шейкере. Затем пробу центрифугируют в течение 5 мин. на скорости 4000 оборотов в минуту. Супернатант фильтруют в коническую колбу объемом 250 куб. см через ватный тампон. Экстракцию повторяют еще два раза, используя по 30 куб. см метанола и по 1 куб. см 0,1 н соляной кислоты и помещая каждый раз на 5 мин. в ультразвуковую ванну и на 30 мин. на шейкер. Пробы центрифугируют, фильтруют, экстракты объединяют в конической колбе объемом 250 куб. см. Объединенный экстракт фильтруют через фильтр "красная лента" в концентратор объемом 250 куб. см и упаривают на роторном вакуумном испарителе до водного остатка (2 - 2,5 мл).

К водному остатку добавляют 6 мл подвижной фазы и фильтруют через плотный ватный тампон в цилиндр на 10 куб. см.

9.1.2. Очистка экстракта на концентрирующих патронах Диапак C16.

Полученный в п. 9.1.1 раствор наносят на подготовленный патрон Диапак C16, элюат собирают в концентратор объемом 100 куб. см. Патрон промывают 10 куб. см подвижной фазы, элюаты объединяют в концентраторе объемом 100 куб. см.

После очистки элюат выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см подвижной фазы, фильтруют от механических примесей на фильтр-патроне для шприцев Cromafil-PET 20/25 с размером пор 0,20 мкм и 5 куб. мм пробы вводят в хроматограф.

Хроматограф жидкостной Agilent 1200 LCMS с диодно-матричным детектором G1315B с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 250 мм x 4,6 мм, зернение 5 мкм, фирма "Waters".

Предколонка стальная Zorbax Eclipse XDB-C8, 12,5 мм x 2,1 мм, зернение 5 мкм, фирма "Agilent".

Температура колонки: 30 °C.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода-муравьиная кислота в соотношении 1:99:0,4.

Длина волны: 300 нм.

Время удерживания Малеинового гидразида: 4,9 мин. +/- 3%.

Чувствительность не менее 100 mAU (миллиединиц абсорбции) на шкалу.

Объем вводимой пробы: 5 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Agilent Technologies ChemStation for LC 3D.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Малеинового гидразида рассчитывают по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

где дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 4,0 мг/кг" <*>

--------------------------------

<*> 4,0 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Российский государственный аграрный университет МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов".