"МУК 4.1.2384-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Пропаргита в семенах и масле сои методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.07.2008)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА имени К.А. Тимирязева, Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" (Калинин В.А., Калинин А.В., Третьякова О.А., Разумихин М.В.).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 3 апреля 2008 г. N 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 5 сентября 2008 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения уровня остаточных количеств Пропаргита в семенах и масле сои в диапазоне 0,05 - 0,5 мг/кг.

Пропаргит

2-(4-трет-Бутилфенокси)циклогексил проп-2-инил сульфит (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 350,5.

Агрегатное состояние: жидкость.

Цвет, запах: бесцветный, маслянистый, без запаха.

Давление насыщенного пара при 25 °С - 0,04 мПа.

Температура кипения: разрушается при 210 °С (атмосферное давление).

Растворимость в воде: 0,215 мг/куб. дм при 25 °С.

Растворимость в органических растворителях: полностью смешивается с гексаном, дихлорметаном, метанолом и ацетоном.

В России установлен ВМДУ в семенах и масле сои - 0,1 мг/кг.

Область применения препарата:

Пропаргит - несистемный акарицид с преимущественно контактным действием. Оказывает небольшое ингаляционное воздействие. Ингибирует митохондриальную АТФ-азу, что приводит к прекращению роста и нарушению дыхания у клещей.

Рекомендуется для опрыскивания растений против клещей в посадках плодовых, ягодных и цитрусовых культур, на виноградниках, в посевах сои, на плантациях хмеля, а также на декоративных культурах с рекомендуемой нормой расхода 0,8 - 1,8 кг д.в./га.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности Р = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на определении Пропаргита методом капиллярной ГЖХ с использованием детектора по захвату электронов или пламенно-фотометрического детектора после экстракции его из матрицы органическим растворителем, очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями и последующей очисткой экстракта на колонках с Флоризилом и при необходимости патронах Диапак-нитрил.

Идентификация проводится по времени удерживания. Количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Избирательность обеспечивается путем подбора капиллярной колонки и условий программирования температуры.

Весы аналитические "OHAUS", SUM 11140.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г, "ACCULAB", V600.

Колбы мерные на 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц на 10 куб. мм, ТУ 2.833.106.

Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

Пропаргит, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 96,1%

Азот особой чистоты, ГОСТ 9293-74.

Ацетон, х.ч., ТУ 6-09-3513-86.

Ацетонитрил, ТУ 6-09-3534-87.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-72.

н-Гексан, ч., ТУ 6-09-3375-78.

Гелий очищенный марки "А", ТУ 51-940-80.

Натрий сернокислый безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрия хлорид, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Концентрирующие патроны Диапак-нитрил, ТУ 4215-002-05451931-94.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Алонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Диапак.

Аппарат для встряхивания проб "SKLO UNION TYP LT1".

Банки с крышками для экстракции на 250 куб. см, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Ванна ультразвуковая "UNITRA" UNIMA OLSZTYN UM-4.

Воронки химические для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi с водяной баней.

Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 куб. см, КПШ-100, КПШ-250, ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5 (5% Фенил и 95% метилсилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм, фирмы Хьюлетт Паккард.

Концентраторы грушевидные и круглодонные объемом 100 и 250 куб. см, ГОСТ 10394-75.

Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Стаканы стеклянные объемом 100 - 500 куб. см, ГОСТ 25366-80Е.

Установка для перегонки растворителей.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ-6-09-1678-86.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, построение калибровочной кривой.

7.1.1. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил перегоняют.

7.1.2. Очистка гексана

Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 441).

7.1.3. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 438 - 439).

7.2.1. Приготовление стандартных растворов

0,0100 г Пропаргита (аналитического стандарта) вносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, растворяют навеску в 50 - 60 куб. см гексана и затем доводят объем до метки гексаном (стандартный раствор N 1, концентрация 100 мкг/куб. см). Раствор хранится в холодильнике.

Методом последовательного разбавления исходного раствора N 1 гексаном готовят стандартный раствор N 2 с концентрацией 10,0 мкг/куб. см.

Из раствора N 2 готовят рабочие растворы Пропаргита в гексане с концентрацией 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мкг/куб. см для построения калибровочного графика и для внесения в образцы, которые могут храниться в холодильнике не более 10 суток.

7.2.2. Приготовление элюирующей смеси для работы на колонках с Флоризилом и патронами Диапак-нитрил

1. В мерную колбу на 100 куб. см наливают около 50 куб. см ацетона, добавляют 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты и доводят объем в колбе до метки ацетоном, и хорошо перемешивают.

2. В колбу на 250 куб. см наливают 100 куб. см гексана и 10 куб. см подкисленного ацетона (по п. 1). Смесь хорошо перемешивают.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Пропаргита в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мкг/куб. см (ЭЗД) и 1,0; 5,0; 10; 20,0 мкг/куб. см (ПФД).

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм (ЭЗД) или 3 куб. мм (ПФД) каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

По полученным данным строят градуировочный график зависимости площади хроматографического пика в мВ от концентрации Пропаргита в растворе в мкг/куб. см (рисунок 1 - не приводится).

7.4.1. Подготовка колонки с Флоризилом

В носик пластиковой хроматографической колонки (высота 15 см, диаметр 1,5 см) помещают стекловату и заполняют колонку 5 г Флоризила, уплотняя его периодическим постукиванием по колонке. На слой Флоризила насыпают слой безводного сернокислого натрия толщиной 1 см.

Колонку промывают 10 куб. см ацетона, 15 куб. см гексана и просушивают.

7.4.2. Проверка хроматографического поведения Пропаргита на колонках с Флоризилом

При поступлении новой партии Флоризила проводят изучение поведения Пропаргита на колонке. В концентратор вносят 1 см стандартного раствора Пропаргита в гексане с концентрацией 1 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе. Добавляют 5 куб. см гексана, растворяют содержимое концентратора и наносят на колонку, подготовленную, как описано в пункте 7.4.1.

В концентратор добавляют 5 куб. см гексана, ополаскивают стенки и снова наносят на колонку. Затем промывают колонку 5 куб. см гексана, смесью гексан - ацетон в соотношении 9:1 и весь элюат отбрасывают. Пропаргит элюируют с колонки последовательно 2-мя порциями элюирующей смеси (п. 7.2.2) по 5 куб. см каждая. Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха при температуре водяной бани не выше 25 - 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 куб. см гексана и 1 куб. мм (ЭЗД) или 3 куб. мм (ПФД) пробы вводят в хроматограф.

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 мл/мин.

7.5.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак-нитрил

Патрон Диапак-нитрил устанавливают на алонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 5 куб. см ацетона, затем 10 куб. см гексана. Элюат отбрасывают. Патрон сушат под вакуумом 1 - 2 мин.

7.5.2. Проверка хроматографического поведения Пропаргита на концентрирующем патроне Диапак-нитрил

В концентратор вносят 1 куб. см стандартного раствора Пропаргита в гексане с концентрацией 1 мкг/куб. см и выпаривают его досуха на ротационном вакуумном испарителе. Добавляют 5 куб. см гексана, растворяют содержимое концентратора. Затем этот объем пропускают с помощью медицинского шприца через предварительно подготовленный в соответствии с п. 7.5.1 патрон Диапак-нитрил со скоростью 1 - 2 капли в секунду. Элюат собирают.

Пропаргит элюируют с колонки последовательно 2-мя порциями элюирующей смеси (п. 7.2.2) по 5 куб. см каждая (первой порцией омывают концентратор). Каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и выпаривают досуха при температуре водяной бани не выше 25 - 30 °С.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 куб. см гексана и 1 куб. мм (для ЭЗД) пробы вводят в хроматограф (при анализе на ЭЗД).

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый объем элюента.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов", N 2051-79 от 21.08.79, а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб", ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках" и ГОСТ 7825-96 "Масло соевое. ТУ".

Пробы семян сои, доведенных до стандартной влажности, хранят в бумажных или тканевых мешочках в сухом хорошо проветриваемом шкафу, недоступном для грызунов. Перед анализом семена сои размалывают на лабораторной мельнице.

Пробы масла хранят в герметично закрытой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С не более 30 дней.

Для исследовательских целей допускается получение масла в лаборатории из проб семян методом экстракции горячим растворителем при температуре не выше 40 °С.

9.1.1 Экстракция и очистка экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися растворителями

Навеску измельченных семян сои массой 10 г помещают в полипропиленовую банку для экстракции, заливают смесью ацетона и гексана в соотношении 1 к 7 (далее - смесь для экстракции) объемом 75 куб. см и ставят на 30 мин. на встряхиватель. Далее банку переносят в ультразвуковую ванну на 10 мин. Экстракт фильтруют в концентратор через фильтр "красная лента".

Экстракцию повторяют еще дважды смесью для экстракции порциями по 50 куб. см, встряхивая образец по 15 мин. и помещая в ультразвуковую ванну на 5 мин.

Объединенные порции экстракта выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.

Далее масляный остаток в колбе переносят ацетонитрилом в делительную воронку тремя порциями по 20 куб. см и промывают ацетонитрильный экстракт тремя порциями гексана по 40 куб. см. Очищенный ацетонитрильный экстракт собирают в концентратор и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °С.

В чистую делительную воронку пробу переносят тремя порциями ацетонитрила по 3 куб. см и добавляют 50 куб. см дистиллированной воды, предварительно омыв ею концентратор. Пропаргит переэкстрагируют в гексан тремя порциями по 40 куб. см каждая. Гексан собирают в концентратор, пропуская его через слой безводного сернокислого натрия. Водную фазу отбрасывают. Объединенный гексановый экстракт выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 35 °С.

9.1.2. Очистка пробы на колонках с Флоризилом

К сухому остатку в концентраторе, полученному после упаривания гексанового экстракта, добавляют 5 мл гексана. Содержимое колбы интенсивно перемешивают и полученный раствор наносят на подготовленную колонку согласно пункту 7.4.1. В концентратор добавляют 5 куб. см гексана, ополаскивают стенки и снова наносят на колонку. Затем промывают колонку последовательно 5 куб. см гексана, 5 куб. см смеси гексан - ацетон в соотношении 9:1 и весь элюат отбрасывают.

Пропаргит элюируют с колонки в чистый концентратор 10 куб. см элюирующей смеси (п. 7.2.2). Растворитель выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не более 35 °С досуха. Если такой очистки окажется недостаточно, то пробу очищают на патроне Диапак-нитрил.

9.1.3. Очистка пробы на концентрирующем патроне Диапак-нитрил

Сухой остаток в концентраторе, полученный после упаривания элюата с колонки с Флоризилом, растворяют в 5 куб. см гексана. Содержимое колбы наносят на подготовленный согласно п. 7.5.1 патрон Диапак-нитрил. Элюат с патрона отбрасывают.

В концентратор добавляют 5 - 10 куб. см элюирующей смеси (точный объем элюирующей смеси определяют по п. 7.5.2), ополаскивают стенки и наносят на патрон. Собранный в чистый концентратор элюат выпаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не более 35 °С досуха.

Образец масла сои массой 10 г помещают в химический стакан объемом 100 куб. см, прибавляют 30 куб. см ацетонитрила, тщательно перемешивают стеклянной палочкой и переносят в сухую делительную воронку объемом 500 куб. см. Затем химический стакан обмывают двумя порциями ацетонитрила объемом по 30 куб. см и объединяют с раствором в делительной воронке. В воронку с ацетонитрильной суспензией масла приливают 40 куб. см гексана, предварительно обмыв им стаканчик, и осторожно встряхивают воронку в течение 1 мин. После разделения слоев в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой собирают в коническую колбу объемом 250 куб. см, а гексан отбрасывают. Повторяют операцию еще дважды, используя также по 40 куб. см гексана.

Ацетонитрильный экстракт собирают в концентратор и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не более 35 °С досуха.

Затем пробу переносят в чистую делительную воронку тремя порциями ацетонитрила по 3 куб. см и добавляют 50 куб. см дистиллированной воды, предварительно омыв ею концентратор. Пропаргит переэкстрагируют в гексан тремя порциями по 40 куб. см каждая. Гексан собирают в концентратор, пропуская его через слой безводного сернокислого натрия. Водную фазу отбрасывают. Объединенный гексановый экстракт выпаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 35 °С.

Далее пробу очищают на хроматографических колонках с Флоризилом и на патроне Диапак-нитрил, как описано в пунктах 9.1.2 и 9.1.3.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-5 (5% фенил - 95% метилсилоксана), длина 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки 0,25 мкм.

Температура детектора - 320 °С, испарителя - 250 °С, программированный нагрев колонки со 160 °С (выдержка 1 минута) по 10 град./мин. до 220 °С, с 220 °С по 15 град./мин. до 250 °С.

Газ 1 - тип регулятора расхода газа РРГ 11, режим нормальный, скорость 20 см/с, давление 89,45 кПа.

Газ 2 (гелий) - сброс 1:10, расход 0,5 куб. см/мин.

Газ 3 (азот, поддув детектора) - 45 куб. см/мин.

Продувка: температура колонки 270 °С, газ 2 - 60 куб. см/мин., газ 3 - 60 куб. см/мин., время 5 минут.

Абсолютное время удерживания Пропаргита - 12 мин. 53 сек. +/- 2%.

Линейность детектирования сохраняется в пределах - 0,5 - 5,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией Пропаргита 5,0 мкг/куб. см, соответственно разбавляют.

Количественное определение Пропаргита проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов Пропаргита с концентрацией 0,5 - 5,0 мкг/куб. см.

Колонка хроматографическая капиллярная кварцевая НР-1 (100% метилсилоксана), длина 7,5 м, внутренний диаметр 0,543 мм.

Температура детектора - 240 °С, испарителя - 230 °С, программированный нагрев колонки со 190 °С по 10 град./мин. до 220 °С, с 220 °С по 25 град./мин. до 275 °С.

Газ 1 (азот) - тип регулятора расхода газа РРГ 11, режим нормальный, скорость 66 см/с, давление 15,0 кПа.

Газ 2 (азот) - деление потока 1:1, расход 9,6 куб. см/мин.

Абсолютное время удерживания Пропаргита - 5 мин. 50 сек. +/- 2%.

Объем вводимой пробы - 3 куб. мм.

Линейность детектирования сохраняется в пределах - 3,0 - 30,0 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят в хроматограф 3 раза и вычисляют среднюю площадь пика.

Образцы, дающие пики больше, чем стандартный раствор с концентрацией Пропаргита 10,0 мкг/куб. см, соответственно разбавляют.

Количественное определение Пропаргита проводят по методу абсолютной калибровки посредством сравнения с хроматограммами стандартных растворов Пропаргита с концентрацией 1,0 - 10,0 мкг/куб. см.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программа сбора и обработки хроматографической информации "Хроматэк Аналитик", версия 1.20.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Пропаргита рассчитывают по формуле:

где:

Х - содержание Пропаргита в пробе, мг/кг;

Sст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

Sпр - высота (площадь) пика образца, мм;

А - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г;

Р - содержание Пропаргита в аналитическом стандарте, %.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

Проверка приемлемости результатов параллельных определений:

за результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,05 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,05 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

Калинин В.А., профессор; Калинин А.В., мл. н. сотр.; Разумихин М.В., н. сотр.; Третьякова О.А., инженер.

Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева. Учебно-научный консультационный центр "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов". 127550, Москва, Тимирязевская ул., 53/1. Телефон (495)976-37-68, факс (495)976-43-26.