"МУК 4.1.2385-08. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств имазалила в семенах подсолнечника, рапса, зерне сои и растительном масле методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 02.07.2008)

1. Разработаны Всероссийским научно-исследовательским институтом защиты растений.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 03.04.2008 N 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 2 июля 2008 г.

4. Введены в действие с 5 сентября 2008 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод капиллярной газожидкостной хроматографии для определения в семенах подсолнечника, сои и рапса массовой концентрации имазалила в диапазоне концентраций 0,01 - 0,1 мг/кг, в растительном масле - 0,02 - 0,2 мг/кг.

Имазалил

Структурная формула (не приводится).

(+/-)-1-(бета-аллилокси-2,4-дихлорфенилэтил)имидазол (IUPAC).

Мол. масса: 297,2.

Область применения: системный фунгицид с защитным и лечебным действием.

Гигиенические нормативы для имазалила: МДУ в семенах подсолнечника, сои и рапса 0,02 мг/кг, в масле подсолнечника, сои и рапса 0,04 мг/кг.

Методика основана на определении имазалила методом капиллярной ГЖХ с использованием термоионного детектора после его извлечения из образцов органическими растворителями с последующей очисткой перераспределением между двумя несмешивающимися жидкими фазами и на колонке с силикагелем.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Избирательность метода определения имазалила достигается условиями подготовки проб и хроматографирования.

Аналитический стандарт имазалила с массовой долей основного вещества 97,5%.

Азот газообразный высокой чистоты, ТУ 301-07-25-89.

Ацетон, ос.ч., ТУ 2633-004-11291058-94.

Вода дистиллированная, ГОСТ 7602-76.

н-Гексан, х.ч., ТУ 6-09-3375-78.

Дихлорметан, х.ч., ТУ 6-09-2662-77.

Натрий сернокислый б/в (сульфат), ч.д.а., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, ч.д.а., ГОСТ 4233-77.

Стекловата.

Силикагель 60 (230 - 400 меш) (Мерк, Германия).

Фильтры бумажные, красная лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Фильтры бумажные, белая лента, ТУ 2642-001-42624157-98.

Элюенты для колоночной хроматографии:

элюент N 1 - гексан,

элюент N 2 - гексан:ацетон 19:1 (по объему),

элюент N 3 - гексан:ацетон 4:1 (по объему),

элюент N 4 - ацетон.

Хроматограф газовый "Кристалл 2000М" с ТИД или аналогичный.

Колонка капиллярная кварцевая длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, с неподвижной фазой НР-35, толщина слоя 0,25 мкм.

Ванна ультразвуковая УЗВ/100 ТН или аналогичная.

Весы аналитические типа ВЛА-200, ГОСТ 24104-2001.

Весы лабораторные типа ВЛКТ-500, ГОСТ 24104-2001.

Воронки делительные емкостью 10, 250 и 500 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Воронки химические конусные, ГОСТ 25336-82.

Колбы-концентраторы емкостью 100 и 250 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Колбы плоскодонные емкостью 100 и 300 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Колбы мерные со шлифом емкостью 25, 50, 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Колонка стеклянная для колоночной хроматографии длиной 27 см, диаметром 7 мм.

Мельница электрическая лабораторная, ТУ 46-22-236-79 или аналогичная.

Микрошприц МШ-10, ТУ 2-833-106.

Насос водоструйный, ГОСТ 10696-75.

Ротационный вакуумный испаритель Buchi R-200/205 (Швейцария) или аналогичный.

Пипетки мерные емкостью 1, 2, 5 и 10 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Пробирки мерные со шлифом емкостью 10,0 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Стаканы химические на 100, 200 и 500 куб. см, ГОСТ 25336-82.

Цилиндры мерные емкостью 10, 50 и 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Отбор проб семян подсолнечника, сои и рапса для анализа проводят в соответствии с ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб".

Пробы семян просушивают до стандартной влажности и хранят в закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре. Перед анализом пробы семян рапса рассыпают на бумаге или кальке и пинцетом удаляют включения. Семена измельчают в фарфоровой ступке и после перемешивания измельченной массы отбирают усредненную аналитическую пробу.

Пробы растительного масла хранят в холодильнике при температуре +4 - 6 °C в закрытой стеклянной таре не более 2 месяцев.

2.4.1. Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Перед началом работы рекомендуется проверить чистоту применяемых органических растворителей. Для этого 100 мл растворителя упаривают в ротационном вакуумном испарителе при температуре +40 °C до объема 1 куб. см и хроматографируют. При обнаружении мешающих определению примесей очистку растворителей производят в соответствии с общепринятыми методиками.

2.4.2. Приготовление градуировочных растворов

Основной раствор готовят растворением в ацетоне (марки ос.ч.) 100 мг аналитического стандарта имазалила в мерной колбе на 100 куб. см. Из полученного раствора с концентрацией 1 мг/куб. см готовят градуировочные растворы с концентрациями 0,2, 0,4, 1,0, 2,0 мкг/куб. см методом последовательного разбавления ацетоном.

Для определения полноты извлечения имазалила из образцов семян используют ацетоновые растворы, для внесения имазалила в образцы растительного масла используют растворы, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления гексаном.

2.4.3. Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика - концентрация имазалила в растворе) в хроматограф вводят по 2 куб. мм градуировочных растворов (не менее 3-х параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4-х точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации имазалила в градуировочном растворе (мкг/куб. см).

2.4.4. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстракта

Силикагель не менее 5 часов прокаливают при 130 °C, охлаждают и хранят в эксикаторе. Навеску силикагеля 98,5 г помещают в круглодонную колбу и добавляют 1,5 г дистиллированной воды. Колбу плотно закрывают и интенсивно встряхивают в течение 5 минут. Затем колбу присоединяют к ротационному испарителю при атмосферном давлении и медленно вращают 2 часа. Деактивированный таким образом силикагель используют в течение 5 дней.

На дно стеклянной колонки помещают тампон из стекловаты, слой 0,5 см безводного сульфата натрия и заполняют суспензией 2 г силикагеля в 5 куб. см гексана при открытом кране, сверху вносят слой 0,5 см безводного сульфата натрия и промывают колонку 10 куб. см гексана. Когда уровень растворителя достигнет верхнего слоя в колонке, кран закрывают. Колонка готова к работе.

2.4.5. Проверка хроматографического поведения имазалила на колонке с силикагелем

5 мл градуировочного раствора с известной концентрацией имазалила упаривают досуха на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.

В колбу с сухим остатком вносят 2 куб. см элюента N 1 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 5 мин. Затем пипеткой переносят раствор на колонку. Открывают кран и дают раствору впитаться. Когда уровень растворителя достигнет верхнего края колонки, кран закрывают. Колбу дважды ополаскивают 2 куб. см элюента N 1 и пипеткой переносят раствор на колонку. Начинают элюирование в градуированную пробирку с притертой пробкой на 10 куб. см. После завершения пробирку закрывают и встряхивают. Таким образом, получена фракция с элюентом N 1.

Ту же колбу, где был сухой остаток, ополаскивают 2 куб. см элюента N 2 и помещают колбу в ультразвуковую ванну на 5 мин. Затем пипеткой переносят раствор на колонку, колбу ополаскивают 2 куб. см элюента N 2 и переносят на колонку. Таким образом, получена фракция с элюентом N 2.

Эту процедуру повторяют с элюентами 3 и 4 и, таким образом, готовят фракции с элюентами N 3 и N 4.

Элюаты упаривают, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Фракции, содержащие имазалил, объединяют, упаривают, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Рассчитывают содержание имазалила в суммарном элюате, определяя полноту ивлечения из колонки и необходимый для этого объем элюента.

Примечание: профиль вымывания имазалила может изменяться при использовании силикагеля другой партии или марки.

2.4.6. Подготовка приборов и средств измерения

Установка и подготовка всех приборов и средств измерения проводится в соответствии с требованиями технической документации.

Навеску 20 г размолотых до "крупки" на лабораторной мельнице семян подсолнечника, или зерна сои, или раздавленных в фарфоровой ступке семян рапса помещают в коническую колбу объемом 250 куб. см, смачивают 25 куб. см теплой дистиллированной воды и оставляют на 30 минут для набухания. Затем добавляют 50 куб. см ацетона и экстрагируют имазалил в ультразвуковой ванне в течение 15 мин.

Экстракт фильтруют через фильтр "белая лента" на воронке Бюхнера. Экстракцию повторяют дважды.

Объединенный фильтрат переносят в делительную воронку, добавляют 30 куб. см гексана и встряхивают в течение 2 - 3 мин. После разделения фаз гексановый слой отбрасывают, а водно-ацетоновый возвращают в делительную воронку и промывают еще 2 - 3 раза порциями гексана по 30 куб. см.

Водно-ацетоновый экстракт упаривают на роторном испарителе до водного остатка. Раствор количественно переносят в делительную воронку на 250 куб. см, добавляют 10 куб. см насыщенного раствора хлористого натрия и встряхивают до растворения соли, затем приливают 50 куб. см дихлорметана, встряхивают 2 мин. и оставляют до полного разделения фаз. Водную фазу отбрасывают, а органическую фазу фильтруют в концентратор объемом 250 куб. см через фильтр "красная лента" со слоем безводного сернокислого натрия. Переэкстракцию имазалила из водной среды в органическую повторяют дважды порциями дихлорметана по 30 куб. см. Объединенный фильтрат упаривают на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C до сухого остатка.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. При наличии мешающих примесей дополнительную очистку проводят на колонке с силикагелем по п. 2.5.3.

Навеску масла 10 г растворяют в 50 куб. см гексана в плоскодонной колбе объемом 100 куб. см в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. и оставляют на час. Затем раствор количественно переносят в делительную воронку объемом 250 мл, добавляют 50 куб. см ацетонитрила и встряхивают воронку в течение 1 - 2 мин. После разделения фаз ацетонитрильный слой собирают. Экстракцию ацетонитрилом повторяют. Объединенный экстракт переносят в чистую делительную воронку на 250 куб. см и ацетонитрильный слой трижды промывают гексаном порциями по 15 - 20 куб. см. Гексановый слой отбрасывают, а промытый ацетонитрильный экстракт упаривают до сухого остатка на роторном испарителе при температуре не выше 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. При наличии мешающих примесей дополнительную очистку проводят на колонке с силикагелем по п. 2.5.3.

В колбу с сухим остатком вносят 2 куб. см элюента N 1 и растворяют его в ультразвуковой ванне в течение 5 мин. Пипеткой полностью переносят раствор на колонку. Открывают кран и дают пробе впитаться. Когда уровень растворителя достигнет верхнего края колонки, кран закрывают. Колбу ополаскивают 2 куб. см элюента N 1, пипеткой переносят раствор на колонку и открывают кран. Элюат отбрасывают.

Продолжают элюирование, как описано в п. 2.4.5 элюентами 2 и 3. Элюаты, содержащие элюенты N 2 и N 3, отбрасывают.

Продолжают элюирование, как описано выше, элюентом N 4. Собранную фракцию упаривают, сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и хроматографируют. Рассчитывают содержание имазалила в пробе.

Условия хроматографирования: газовый хроматограф "Кристалл 2000М" с ТИД, колонка кварцевая капиллярная длиной 30 м, диаметром 0,25 мм, неподвижная фаза НР-35, толщина слоя 0,25 мкм. Температура колонки программируется от 100 °C (10 сек.) до 250 °C со скоростью 10 °C/мин. Температура термостата детектора 370 °C, испарителя 240 °C. Расход газа-носителя 1 (азот) - 1,8 куб. см/мин, водорода - 14 куб. см/мин., воздуха - 200 куб. см/мин. Расход газа 2 (азот) в течение 10 с - 0 куб. см/мин., затем 3 куб. см/мин. Расход газа 3 (азот) - 35 куб. см/мин. Дозируемый объем 2 куб. мм. Анализируемый объем 1 куб. см. Время удерживания имазалила 16 мин. 34 с +/- 5 с.

Содержание имазалила в пробе рассчитывают методом внешнего стандарта по формуле:

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Результат анализа представляют в виде:

ДЕЛЬТА - граница абсолютной погрешности, мг/кг;

дельта - граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе "менее нижней границы определения" (например: менее 0,01 мг/кг*, где * - 0,01 мг/кг - предел обнаружения).

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

5.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

5.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

5.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

При проведении работы необходимо соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами (ГОСТ 12.1005-88).

При выполнении измерений с использованием газового хроматографа и работе с электроустановками соблюдать правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов.

Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91.

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом газожидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 5.