"МУК 4.1.2267-07. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Римсульфурона в кукурузном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"
(утв. Роспотребнадзором 24.09.2007)

1. Разработаны Российским государственным аграрным университетом - МСХА им. К.А. Тимирязева, Учебно-научным консультационным центром "Агроэкология пестицидов и агрохимикатов" Минсельхоза России.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-гигиеническому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 21 июня 2007 г.).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 24 сентября 2007 г.

4. Вводятся в действие с 10 декабря 2007 г.

5. Введены впервые.

Настоящие Методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации Римсульфурона в диапазоне 0,01 - 0,5 мг/кг в кукурузном масле.

Название действующего вещества по ИСО: Римсульфурон.

Название по ИЮПАК: 1-(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)-3-(3-этилсульфонил-2-пиридилсульфонил)мочевина.

Структурная формула (не приводится).

Молекулярная масса: 431,4.

Агрегатное состояние: порошок.

Цвет, запах: белого цвета, без запаха.

Температура плавления: 88,1 °С.

Коэффициент распределения н-октанол - вода: 4,8 (pH 5); 4,65 (pH 7); 5,55 (pH 9).

рКа - 4,0, растворимость в воде: 0,135 мг/куб. дм (pH 5), 7,3 мг/куб. дм (pH 7), 5,56 мг/куб. дм (pH 9).

Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм при 25 °С): ацетон - 14,8, ацетонитрил - 17,2, этилацетат - 2,85, гексан < 0,01, метанол - 1,55, N, N-диметилформамид - 241, хлористый метилен - 35,5.

ДСД - 0,02 мг/кг/сутки; МДУ в зерне кукурузы 0,01 мг/кг, в кукурузном масле не установлен.

Область применения препарата:

Римсульфурон - гербицид системного действия, проникающий через корни и листья растений и ингибирующий биосинтез изолейцина и валина. Рекомендуется как послевсходовый гербицид для контроля однолетних и многолетних трав и некоторых широколистных сорняков на посевах кукурузы. Также используется на посадках картофеля и томатов. Хорошо подавляет развитие чувствительных к нему сорняков при норме расхода 15 г д.в./га.

Римсульфурон в России применяется в качестве гербицида в посевах кукурузы и картофеля с нормой расхода до 15 г д.в./га. Он также входит в состав смесевых препаратов и комбинации с другими гербицидами.

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в таблице 2.

Метод основан на определении Римсульфурона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового детектора после очистки перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на концентрирующих патронах на основе силикагеля (Диапак Амин).

Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение - методом абсолютной калибровки.

В предлагаемых условиях анализа метод специфичен. Специфичность обеспечивается подбором состава подвижной фазы и выбором колонок различной полярности.

Весы аналитические "OHAUS", СИГМА 11140.

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 600 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г "ACCULAB" V600.

Колбы мерные на 25, 50 и 100 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50 - 100 куб. мм.

Пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0 куб. см, ГОСТ 20292-74.

Хроматограф жидкостной Уотерс 510 с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны и чувствительностью не ниже 0,005 единиц адсорбции на шкалу или другой аналогичного типа, номер госрегистрации 15311-02.

Цилиндры мерные на 10, 25 и 50 куб. см, ГОСТ 1770-74.

Допускается использование средств измерений с аналогичными или лучшими характеристиками.

Римсульфурон, аналитический стандарт с содержанием действующего вещества 99,6% (фирма Дюпон де Немур Интернешнл, С.А.).

Ацетон, осч., ТУ 2633-00-4-11291058-94.

Ацетонитрил, осч., УФ-200 нм, ТУ 6-09-2167-84.

Вода бидистиллированная, деионизированная, ГОСТ 7602-72.

Гексан, х.ч., д/спектроскопии, ТУ 6-09-06-657-84.

Калий марганцовокислый, ч.д.а., ГОСТ 20490-75.

Кальций хлористый, х.ч., ГОСТ 4161-76.

Кислота орто-фосфорная, 85%, Fluka, каталожный номер 79621.

Кислота уксусная ледяная, ГОСТ 61-75.

Натрий сернокислый, безводный, х.ч., ГОСТ 4166-76.

Натрий хлористый, х.ч., ГОСТ 4233-77.

Этиловый эфир уксусной кислоты, ч.д.а., ГОСТ 223000-76.

Концентрирующие патроны Диапак Амин (0,6 г), ТУ 4215-002-05451931-94.

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичными или лучшими характеристиками.

Аллонж прямой с отводом для вакуума для работы с концентрирующими патронами Диапак Амин.

Аппарат для встряхивания проб "SKLO UNION TYP LT1".

Банки с крышками для экстракции на 250 мл, полипропилен, кат. N 3120-0250, NALGENE.

Ванна ультразвуковая "UNITRA" UNIMA OLSZTYN UM-4.

Воронки химические для фильтрования стеклянные, ГОСТ 8613-75.

Воронки делительные на 250 куб. см, ГОСТ 10054-75.

Испаритель ротационный Rota vapor R110 Buchi или ИР-1М, ТУ 25-11-917-74 с водяной баней.

Колбы конические плоскодонные на 100 и 250 куб. см, КПШ-100, КПШ-250, ГОСТ 10394-72.

Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, с внутренним диаметром 4,6 мм, Symmetry Shield RP18, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.

Колбы конические плоскодонные объемом 250, 500 и 1000 куб. см, ГОСТ 9737-70.

Концентраторы грушевидные и круглодонные объемом 100 и 250 куб. см, ГОСТ 10394-75.

Насос диафрагменный FT.19 фирмы KNF Neu Laboport.

Предколонка хроматографическая стальная Symmetry C18 длиной 20 мм, внутренним диаметром 3,9 мм, зернение 5 мкм, фирма Уотерс.

Стаканы стеклянные объемом 100 - 500 куб. см, ГОСТ 25366-80Е.

Установка для перегонки растворителей.

Фильтры бумажные "красная лента", ТУ-6-09-1678-86.

Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями пор 20 мкм, фирма Уотерс.

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 "Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны". Организация обучения работников безопасности труда - по ГОСТ 12.0.004.

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией "лаборант", имеющего опыт работы в химической лаборатории.

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

- процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;

- выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка растворителей (при необходимости), приготовление растворов, кондиционирование хроматографической колонки, подготовка концентрирующих патронов Диапак Амин для очистки экстракта, проверка хроматографического поведения вещества на патронах, построение калибровочной кривой.

7.1.1. Очистка ацетона

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 438 - 439).

7.1.2. Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил перегоняют.

7.1.3. Очистка гексана

Гексан встряхивают с концентрированной серной кислотой, промывают бледно-розовым раствором перманганата калия до тех пор, пока раствор не перестанет обесцвечиваться, затем промывают водой, сушат над безводным хлористым кальцием и перегоняют (А. Гордон, Р. Форд. Спутник химика, Москва, 1976 г., с. 441).

7.1.4. Очистка бидистиллированной воды

Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцовокислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

7.1.5. Очистка этилового эфира уксусной кислоты

Этиловый эфир уксусной кислоты промывают равным объемом 5% раствора соды, сушат над безводным хлористым кальцием (Беккер г. и др. Органикум, Москва, 1979 г., с. 372), кипятят в течение 1 часа с прокаленным сульфатом магния и затем перегоняют.

7.2.1. Приготовление 0,1% раствора орто-фосфорной кислоты

В мерную колбу объемом 1 куб. дм прибавляют 100 куб. см очищенной воды, 1 куб. см концентрированной орто-фосфорной кислоты, перемешивают, после чего доводят объем до метки очищенной водой.

7.2.2. Приготовление подвижной фазы для ВЭЖХ

В плоскодонную колбу объемом 1 куб. дм помещают 400 куб. см ацетонитрила и 600 куб. см 0,1% раствора орто-фосфорной кислоты. Смесь тщательно перемешивают, пропускают через нее газообразный гелий со скоростью 20 куб. см/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенных газов на 1 минуту.

7.2.3. Приготовление 0,1% раствора уксусной кислоты в этилацетате

В мерную колбу объемом 100 куб. см прибавляют 10 куб. см этилацетата, 0,1 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают, после чего доводят объем до метки этилацетатом.

7.2.4. Приготовление 2% раствора уксусной кислоты в этилацетате

В мерную колбу объемом 100 куб. см прибавляют 10 куб. см этилацетата, 2,0 куб. см ледяной уксусной кислоты, перемешивают, после чего доводят объем до метки этилацетатом.

7.2.5. Приготовление градуировочных растворов

7.2.5.1. Стандартный раствор с концентрацией Римсульфурона 1,0 мг/куб. см

Взвешивают 50 мг Римсульфурона в мерной колбе объемом 50 куб. см. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.2.5.2. Стандартный раствор с концентрацией Римсульфурона 10,0 мкг/куб. см

Из стандартного раствора Римсульфурона с концентрацией 1,0 мг/куб. см отбирают пипеткой 1 куб. см, помещают в мерную колбу объемом 100 куб. см и доводят объем до метки ацетонитрилом при перемешивании.

7.2.5.3. Стандартные растворы Римсульфурона с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для построения калибровочной кривой

Методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см и используют эти растворы для хроматографического исследования.

7.2.5.4. Стандартные растворы Римсульфурона с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см для внесения в образцы масла

Из стандартного раствора в ацетонитриле с концентрацией 1,0 мг/куб. см Римсульфурона методом последовательного разведения ацетоном готовят растворы, содержащие по 5,0; 2,0; 1,0 и 0,5 мкг/куб. см, и используют эти растворы для внесения в образцы масла.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации Римсульфурона в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки с концентрацией 1,0; 0,5; 0,2 и 0,1 мкг/куб. см.

В инжектор хроматографа вводят по 20 мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Измеряют площадь пиков, рассчитывают среднее значение площади пика для каждой концентрации и строят график зависимости площади пика от концентрации Римсульфурона. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений (рисунок 1 - не приводится).

7.4.1. Подготовка концентрирующего патрона Диапак Амин для очистки экстракта

Все процедуры происходят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин.

Патрон Диапак Амин устанавливают на аллонж с отводом для вакуума, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом типа Люер объемом не менее 10 куб. см (используют как емкость для элюентов).

Кондиционирование: концентрирующий патрон промывают 10 куб. см этилацетата. Элюат отбрасывают.

Нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.4.1.1. Проверка хроматографического поведения Римсульфурона на концентрирующем патроне Диапак Амин

Из стандартного раствора Римсульфурона в ацетонитриле, содержащего 1 мкг/куб. см, отбирают 1 куб. см, помещают в круглодонную колбу объемом 100 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе досуха при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, и смыв вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Затем в исходный концентратор добавляют 10 куб. см 0,1% уксусной кислоты в этилацетате, обмывают стенки концентратора и полученный раствор вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Исходный концентратор обмывают тремя порциями по 5 куб. см 2% уксусной кислоты в этилацетате и последовательно вносят на патрон. Элюаты после прохождения каждой порции собирают в отдельные концентраторы, выпаривают досуха, сухой остаток растворяют в 2 куб. см ацетонитрила и хроматографируют. Определяют фракции, содержащие Римсульфурон, объединяют их и рассчитывают объем растворителя, необходимого для вымывания вещества из патрона.

Хроматографическую колонку Symmetry Shield RP18 с предколонкой Symmetry C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при температуре 25 °С и скорости потока подвижной фазы 1 куб. см/мин. 3 - 4 часа.

Отбор проб производится в соответствии с "Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов" (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 8808-91 "Масло кукурузное, ТУ".

Пробы масла кукурузы хранят в плотно закрытой стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике при температуре 0 - 4 °С не более 30 дней.

Для исследовательских целей допускается получение масла в лаборатории из проб зерна методом экстракции горячим растворителем при температуре не выше 40 °С.

Из пробы кукурузного масла отбирают в стакан навеску массой 10 г и переносят ее в делительную воронку объемом 250 куб. см тремя порциями гексана объемом по 30 куб. см. К масляно-гексановой смеси приливают порцию ацетонитрила, предварительно подогретого на водяной бане до 40 °С, объемом по 30 куб. см, встряхивают делительную воронку 2 минуты. После полного разделения фаз в делительной воронке нижний ацетонитрильный слой сливают в концентраторе объемом 250 куб. см, пропуская его через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см. Повторяют экстракцию Римсульфурона еще два раза, используя каждый раз по 30 куб. см ацетонитрила. Экстракты объединяют в концентраторе и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С.

Сухой остаток растворяют в 5 куб. см этилацетата, тщательно обмывая стенки концентратора, и смыв вносят на патрон. Элюат отбрасывают. Затем в исходный концентратор добавляют 10 куб. см 0,1% уксусной кислоты в этилацетате, обмывают стенки концентратора и полученный раствор вносят на патрон. Элюат отбрасывают. Исходный концентратор еще раз обмывают 10 куб. см 2% уксусной кислоты в этилацетате и вносят на патрон. Элюат собирают в концентратор и выпаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и хроматографируют.

Хроматограф "Waters" или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с изменяемой длиной волны.

Колонка стальная Symmetry Shield RP18, 4,6 мм х 25 см, зернением 5 мкм.

Предколонка стальная Symmetry C18, 3,9 мм х 2 см, зернением 5 мкм.

Температура колонки: 25 °С.

Подвижная фаза: ацетонитрил - 0,1% орто-фосфорная кислота в соотношении 40:60.

Длина волны: 230 нм.

Время удерживания Римсульфурона: 10,65 - 11,08 мин.

Чувствительность: 0,003 ед. оптической плотности на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования сохраняется в пределах 2 - 20 нг.

Для обработки результатов хроматографического анализа используется программное обеспечение химического анализа Millenium 3.05.01.

Альтернативная обработка результатов.

Содержание Римсульфурона рассчитывают по формуле:

где:

X - содержание Римсульфурона в пробе, мг/кг или мг/куб. дм;

Sст - высота (площадь) пика стандарта, мм;

Sпр - высота (площадь) пика образца, мм;

A - концентрация стандартного раствора, мкг/куб. см;

V - объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m - масса анализируемого образца, г (куб. см);

P - содержание Римсульфурона в аналитическом стандарте, %.

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

В случае если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

"содержание вещества в пробе менее 0,01 мг/кг" <*>.

--------------------------------

<*> 0,01 мг/кг - предел обнаружения.

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 "Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений".

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости: